于芳蘋，蔣 萍，趙迎春△，李麗敏，楊永益

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院：1.老年干部科；2.神經(jīng)內(nèi)科,上海 201600)

腦梗死是神經(jīng)科常見的急、危、重癥之一，具有很高的致殘率和病死率[1]，顱內(nèi)外大動脈粥樣硬化是腦梗死最主要的原因之一。高血壓、糖尿病、血脂代謝異常和吸煙均是大動脈粥樣硬化型腦梗死(large artery atherosclerotic cerebral infarction,LAACI)的常見危險因素。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性也與LAACI密切相關(guān)[2]。該基因C242T多態(tài)性可致第72位組氨酸被酪氨酸取代，改變了NADPH氧化酶的活性，導(dǎo)致活性氧增加、血管壁自由基代謝紊亂[3]；過多的活性氧可促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增殖，低密度脂蛋白氧化，加速動脈粥樣斑塊形成[4-5]。但也有研究認(rèn)為，該基因多態(tài)性與腦梗死無顯著相關(guān)性，究其原因可能與人種、地域差異，以及研究方法不同有關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果提示C242T基因多態(tài)性與未按病因分型、分組的全因腦梗死有一定的相關(guān)性，但與高血壓、糖尿病、飲酒和吸煙等傳統(tǒng)危險因素相比，C242T基因多態(tài)性對全因腦梗死的影響并不顯著[6]。本研究旨在通過檢測本院LAACI患者的NADPH氧化酶活性、基因型等，探討C242T基因多態(tài)性與LAACI之間有無相關(guān)性，以及它們之間的相關(guān)性強(qiáng)度，從而為LAACI的病因及基因治療途徑提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年12月至2015年12月在本院神經(jīng)內(nèi)科住院的LAACI患者310例(LAACI組)，其中男171例，女139例，平均年齡(66.67±11.91)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：頭顱CT和(或)磁共振成像(MRI)明確診斷；符合1996年第4屆全國腦血管病會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：最近有顱腦損傷、腫瘤、手術(shù)、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病及嚴(yán)重心、肺、腎等疾??；有嚴(yán)重肝腎疾病、血液病及自身免疫性疾病。另選擇同期本院體檢中心健康體檢人員330例(對照組)，其中男179例，女151例，平均年齡(65.76±10.25)歲，與LAACI患者無血緣關(guān)系，無腦梗死家族史。所有研究對象均為上海松江地區(qū)漢族人群。高血壓病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為血壓(BP)≥140/90 mm Hg或正在服用降壓藥物；糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖大于或等于7.0 mmol/L或已服用降血糖藥物治療；吸煙的標(biāo)準(zhǔn)為正在吸煙或有吸煙史。本研究為病例對照研究，已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，全部受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1臨床資料采集 所有研究對象進(jìn)行臨床資料采集，分別記錄性別、年齡、血糖、血壓、飲酒史、吸煙史、高血壓史；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及脂蛋白a[Lp(a)]水平。

1.2.2NADPH氧化酶活性測定 采集入院患者次日清晨空腹肘靜脈血2 mL，采用密度梯度離心法對新鮮血提取單個核白細(xì)胞。采用細(xì)胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測酶活性(NADPH氧化酶活性光度法定量檢測試劑盒，美國Genmed公司)。步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3檢測指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢Cusabio公司)測定所有受試者血漿氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)及丙二醛(MDA)水平。采用ELISA試劑盒(瑞典Mercodia公司)測定所有受試者血漿氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.4聯(lián)合聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP) 采用美國OMEGA公司生產(chǎn)的基因提取試劑盒，提取所有實驗者紅細(xì)胞中的基因組DNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄?由上海生工生物工程股份有限公司合成)：上游5′-TGCTTGTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3′，下游5′-AACACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT-3′。PCR反應(yīng)體系50 μL：模板DNA 15 μL，引物2 μL，2×PCR反應(yīng)混合物25 μL，雙蒸水8 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95.0 ℃ 3 min，變性95.0 ℃ 30 s，退火65.5 ℃ 30 s，延伸72.0 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；末次延伸：72.0 ℃ 10 min，反應(yīng)管冷卻至4.0 ℃。15 μL PCR產(chǎn)物加3 μL上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上電泳30 min， Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察。取PCR產(chǎn)物10 μL，利用RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，酶切反應(yīng)體系共20 μL，37.0 ℃恒溫孵育16 h，取15 μL酶切產(chǎn)物加3 μL上樣緩沖液。酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳結(jié)果，分析基因型。

1.2.5基因測序 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測序進(jìn)一步驗證，由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般臨床資料、血脂水平、NADPH氧化酶活性比較 LAACI組與對照組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。LAACI組MDA水平、NADPH氧化酶活性明顯高于對照組(P<0.05)；吸煙率、飲酒率、高血壓率、收縮壓、舒張壓，以及血糖、TC、TG、LDL-C、ox-HDL、ox-LDL水平在LAACI組均比對照組高(P<0.05)，HDL-C水平比對照組低(P<0.05)，見表1。

表1 兩組基本臨床資料、血脂水平、NADPH氧化酶活性比較

M:Marker;1～4:PCR產(chǎn)物

圖1 NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

M:Marker;1、2、4、5、6:CC基因型；3:TT基因型；7:CT基因型

圖2 NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2NADPH 氧化酶p22phox亞基C242T基因PCR-RFLP 結(jié)果 NADPH 氧化酶p22phox亞基C242T基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)可見長度為353 bp的條帶(圖1)，通過限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切后電泳，在凝膠成像系統(tǒng)可見3種不同條帶：純合子(CC)基因型為長度353 bp的單條帶；雜合子(CT)基因型為3條條帶：353、193、160 bp；純合子(TT)基因型為2條條帶：160、193 bp(圖2)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA堿基測序，測序結(jié)果與酶切結(jié)果一致，見圖3。

A:CT基因型；B：CC基因型；C：TT基因型。箭頭顯示處即為基因多態(tài)性位點，純合型為多態(tài)性位點處出現(xiàn)單條測序峰，雜合型則出現(xiàn)兩條測序峰。紅色峰：T;綠色峰：A;黑色峰：G;藍(lán)色峰：C

圖3 NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因堿基測序圖

2.3兩組基因型及基因頻率比較 LAACI組CT+TT基因型頻率、T等位基因頻率明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

2.4LAACI危險因素二分類Logistic回歸分析 對采集的多項基本臨床資料及實驗室檢測結(jié)果進(jìn)行二分類Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，吸煙、血糖、高血壓、收縮壓、舒張壓、Lp(a)、ox-HDL水平、MDA水平、NADPH氧化酶活性、基因型是LAACI的獨立危險因素，見表3。

表2 LAACI組和對照組基因型頻率及等位基因頻率比較

表3 LAACI危險因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

NADPH氧化酶不僅是體內(nèi)重要的氧化還原酶來催化體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，也是體內(nèi)活性氧的重要來源。p22phox亞基是血管NADPH氧化酶的重要組成部分，由CYBA (cytochrome b245 alpha) 基因編碼。研究顯示，C242T基因多態(tài)性對NADPH氧化酶活性改變的影響較大，與高血壓、頸動脈粥樣硬化、腦梗死等多種疾病相關(guān)。國外學(xué)者認(rèn)為，NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因T等位基因的突變會增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險，在腦梗死患者CT+TT基因型頻率明顯高于正常對照；且在LAACI患者中頻率最高[7-8]。研究還發(fā)現(xiàn)，C242T基因多態(tài)性與腦梗死之間不僅存在顯著的相關(guān)性，而且具有明顯的種族差異，歐洲人種較亞洲人種更為顯著[9]。國內(nèi)學(xué)者張晨等[10]對青島地區(qū)人群的研究顯示，C242T基因多態(tài)性可能是頸動脈粥樣硬化的危險因素之一。本課題組針對上海松江地區(qū)漢族人群NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性與LAACI相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LAACI患者CT+TT基因型頻率及T等位基因頻率明顯高于對照組，與以往的研究結(jié)果一致。但也有學(xué)者報道C242T基因多態(tài)性與腦梗死無關(guān)[11]，可能與研究人群種族差異、研究方法、研究者的認(rèn)識水平及樣本量大小等因素相關(guān)。

2012年一項納入6個關(guān)于C242T基因多態(tài)性與腦梗死相關(guān)性研究(包括1 948例缺血性腦血管病患者和2 357例健康對照者)的Meta分析顯示，C242T基因多態(tài)性與全因缺血性腦梗死無相關(guān)性，但與LAACI具有顯著相關(guān)性[12]。本研究組前期的研究也顯示C242T基因多態(tài)性與未按病因分型、分組的全因腦梗死無顯著的相關(guān)性[6]。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，p22phox亞基C242T基因發(fā)生突變是LAACI的一個獨立危險因素。

研究證實，動脈粥樣硬化與血脂代謝異常密切相關(guān)，LDL、HDL經(jīng)氧化修飾成ox-LDL和ox-HDL后可進(jìn)一步使致動脈粥樣硬化效應(yīng)增強(qiáng)，加速動脈粥樣硬化斑塊形成、進(jìn)展，導(dǎo)致動脈粥樣硬化性心腦血管疾病發(fā)生[13-15]。研究還發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶是中性粒細(xì)胞和血管系統(tǒng)中活性氧的主要來源，活性氧通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)，影響脂質(zhì)蛋白氧化、平滑肌細(xì)胞增生，使動脈粥樣硬化斑塊形成[16-17]。C242T基因多態(tài)性影響了NADPH氧化酶的活性，通過改變血管系統(tǒng)中氧化還原狀態(tài)，升高了血清氧化脂蛋白水平，促進(jìn)動脈粥樣硬化及斑塊形成，同時也導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高[18-19]。本研究也發(fā)現(xiàn)LAACI患者的TG、TC水平高于對照組，而HDL水平低于對照組。另外，LAACI患者的脂蛋白氧化水平明顯高于對照組，具有更高的ox-HDL及MDA水平。揭示C242T基因多態(tài)性可能通過脂蛋白氧化修飾參與了大動脈粥樣硬化斑塊的形成及進(jìn)展，與LAACI發(fā)病密切相關(guān)。

綜上所述，NADPH氧化酶亞基p22Phox C242T基因多態(tài)性與LAACI的發(fā)生相關(guān)。推測C242T基因多態(tài)性可能通過改變NADPH氧化酶的活性，影響脂蛋白氧化修飾，參與了動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和進(jìn)展，是LAACI的發(fā)病機(jī)制之一。因此，降低NADPH氧化酶的活性，抑制脂質(zhì)氧化，減輕動脈粥樣斑塊內(nèi)的氧化應(yīng)激甚至基因治療等每一環(huán)節(jié)將來均有可能成為LAACI患者治療和預(yù)防潛在的藥物靶點和技術(shù)手段[20]，這仍需進(jìn)一步研究證實。

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