張鑫磊 陳盼 夏裕寧 李雪梅 戴春光 譚永星桂林醫(yī)學院研究生院（廣西桂林 5400）；桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院護理部，重癥醫(yī)學科（廣西桂林5400）

腦缺血/再灌注（I/R）損傷是臨床常見的具有嚴重危害的病理生理過程，其損傷機制十分復雜，其中ROS自由基的大量生成及釋放是造成細胞損傷的主要因素，并引起一系列的反應。線粒體是細胞內重要的細胞器，I/R發(fā)生時，線粒體結構破壞、功能受損，啟動了線粒體途徑的凋亡［1］；其功能和結構的研究對于臨床上I/R損傷的防治具有重要意義，并已成為當前該領域的研究熱點之一。氫氣是一種重要的生理性調節(jié)因子，研究［2］證實其在細胞和器官水平上具有明確的抗氧化應激、抗凋亡作用；本研究擬用大鼠局灶性腦I/R損傷模型，觀察腹腔注射純H2后對大鼠腦I/R后神經功能缺損評分及缺血皮質區(qū)神經細胞ROS生成率、線粒體膜電位水平變化、通透性轉換孔（MPTP）開放度和線粒體腫脹度等影響，探討氫氣對大鼠腦I/R損傷腦皮質區(qū)線粒體功能和結構的調控機制與氧化應激時ROS生成率的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年健康雄性SPF級SD大鼠，體質量為（230±10）g，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（桂）2013?0001。

1.1.2 氫氣制備 使用純水氫氣發(fā)生器（濟南浩偉實驗儀器有限公司，型號SPE?300）產氫，電解純水后氫氣氧氣比例為2∶1。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及處理 隨機將大鼠分為假手術組（Sham）、腦I/R組（MOD組）、氫氣治療組（H2組）。應用Longa等的方法改良，使大鼠大腦中動脈阻塞形成實驗所需模型。此模型采用左側頸內動脈線栓法。手術采用4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。90 min后拔出栓線至頸外動脈殘端內進行再灌注24 h。Sham組除不插入栓線外其余操作同上。H2組于拔出栓線時腹腔注射10 mL氫氣，后每隔12 h注射1次。

1.2.2 神經功能缺損評分 采用Longa等的5級4分法進行神經功能缺損評分并記錄神經功能癥狀，0分：正常，無神經損傷癥狀；1分：提尾時右側前肢不能完全伸展；2分：行走時向右側轉圈；3分：行走時向右側跌倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。1～3分即為制模成功。

1.2.3 皮質區(qū)缺血神經細胞線粒體的提取 每組8只，I/R手術24 h后麻醉狀態(tài)下用冰生理鹽水經心臟灌注后取腦，按照線粒體提取試劑盒（索萊寶）步驟進行操作，整個提取過程在0～4℃下進行，線粒體含量以分離出的胞漿蛋白含量表示。提取出的線粒體進行后續(xù)檢測。

1.2.4 ROS生成率測定 按照活性氧檢測試劑盒（碧云天）操作。用熒光酶標儀進行檢測（Tecan，In?finite F500）熒光強度變化情況（測定5～10 min，激發(fā)波長499 nm，發(fā)射波長521 nm）。測試過程保持37℃恒溫。以熒光強度（RFU）來表示生成速率。

1.2.5 JC?1法測定△ψm水平變化 按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC?1）說明操作，用熒光酶標儀進行檢測，激發(fā)波長484 nm，發(fā)射波長590 nm，以熒光強度（RFU）來表示各組膜電位水平。同時將此樣本用倒置熒光顯微鏡進行熒光拍照，正常線粒體內，JC?1聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC?1只能以單體的形式存在于胞漿中，產生綠色熒光。

1.2.6 MPTP開放度測定 按照純化線粒體膜通道孔紅色熒光檢測試劑盒（GENMED）說明操作，用熒光酶標儀進行檢測，激發(fā)波長540 nm，發(fā)射波長580 nm，以熒光強度降低來表明MPTP增強。

1.2.7 線粒體腫脹度的測定 將提取的線粒體懸液分裝出數(shù)份，加入蔗糖溶液，充分混勻后7 000g，4℃，離心10 min后去上清，重復洗滌1次。加入1 mL蔗糖溶液，混勻后移入清潔的比色杯中，再加入1 μL 200 mmol/L的CaCl2溶液充分混勻。用熒光酶標儀進行檢測在單波長540 nm處每隔30 s連續(xù)監(jiān)測3 min，記錄數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗結果用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析處理，所得的數(shù)值均以±s表示。各組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析比較，兩兩比較應用最小顯著性差異法（LSD）檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SD大鼠神經功能缺損癥狀及評分 Sham組的大鼠無行為學異常，行動敏捷，反應正常；MOD組的大鼠精神不振，前進時向右側轉圈跛行，反應遲鈍；H2組的大鼠行動較MOD組敏捷，行走較快且不轉圈，反應較快，神經功能缺損評分明顯低于MOD組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分（n=6）Tab.1 Neurological deficit scores of rats in each group

2.2 ROS生成率 熒光強度的大小代表ROS的生成率，結果顯示，與Sham組相比，MOD組ROS水平明顯升高（P＜0.01）；與MOD組相比，H2組ROS水平有明顯降低（P＜0.01），見圖1。

2.3 線粒體腫脹度的水平 線粒體腫脹時540 nm處吸光度下降，結果顯示，與Sham組相比，MOD組線粒體腫脹度升高（P＜0.01）；與MOD組相比，H2組線粒體腫脹度降低（P＜0.01），見圖2。

2.4 △ψm水平及MPTP開放度 熒光強度的大小代表△ψm水平及MPTP開放度的高低，結果顯示，與Sham組相比，MOD組△ψm水平降低（P＜0.01）、MPTP開放度升高（P＜0.01）；與MOD組相比，H2組△ψm水平升高（P＜0.01）、MPTP開放度降低（P＜0.01），見圖 3、4。熒光拍照顯示，與Sham組相比，MOD組紅色熒光減弱，綠色熒光增強；與MOD組相比，H2組紅色熒光增強，綠色熒光減弱，見圖5。

圖1 R O S生成率Fig.1 Active oxygen generation rate

圖2 線粒體腫脹度Fig.2 Mitochondrial swelling degree

圖3 線粒體膜電位 圖4 線粒體熒光拍照 圖5 MPTP開放度Fig.3 Mitochondrial membrane potential Fig.4 Mitochondrial fluorescence photography Fig.5 Opening degree of mitochondrial permeability transition pore

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，正常生理狀態(tài)下ROS生成率處于低水平，當I/R使腦細胞產生損傷時ROS自由基的大量生成及釋放引起氧化應激損傷；I/R同時可引起線粒體功能受損，最終造成細胞凋亡，但其具體機制及與ROS生成率的關系尚不明確。為探討大鼠腦I/R皮質區(qū)神經細胞線粒體結構功能異常是否由過量的ROS引發(fā)和H2對神經細胞線粒體結構功能的保護作用機制。本研究擬采用大鼠局灶性腦I/R損傷模型，觀察應用H2后對大鼠腦I/R后神經功能缺損評分及缺血皮質區(qū)神經細胞線粒體功能的影響。

線粒體作為細胞呼吸和物質氧化的中心，在各種細胞過程中發(fā)揮關鍵作用［5-7］。研究［8］表明，正常生理狀態(tài)下，線粒體膜的完整性維持著△ψm及MPTP開放度處于正常水平?！鳓譵是由線粒體膜內負外正的電位差特性形成，其在維護線粒體內外物質平衡及保持線粒體正常功能方面發(fā)揮著重要作用?！鳓譵是線粒體合成ATP的動力，一旦△ψm消散和（或）電子傳遞受阻導致△ψm下降，可使細胞不能合成足夠的ATP而無法完成正常的生命活動［10］。MPTP是反映線粒體功能及結構完整性的重要指標，防止其大量開放可有效預防腦I/R引起的神經細胞結構損傷及功能損害，現(xiàn)已逐漸成為關注的熱點［11］。同時線粒體通常被認為是在I/R時ROS產生的主要場所，腦I/R損傷初期即有大量的ROS生成［9］；本研究結果顯示，Sham組沒有發(fā)生I/R，ROS處于正常水平，未產生氧化應激損傷，線粒體功能指標△ψm，MPTP開放度，腫脹度都處于正常水平。MOD組因發(fā)生I/R，ROS生成率升高產生氧化應激損傷；同時△ψm，MPTP開放度，腫脹度都發(fā)生改變，線粒體功能受損。因此筆者猜測I/R時引起ROS升高，過量的ROS自由基破壞了線粒體膜，引起線粒體功能受損，△ψm水平下降，MPTP開放增加，線粒體發(fā)生腫脹。因此減少ROS的生成，維護線粒體結構完整性，穩(wěn)定△ψm水平，抑制并阻斷病理狀態(tài)下MPTP不可逆的長時程開放，是腦保護的重要環(huán)節(jié)。

H2是一種重要的生理性調節(jié)因子，能通過氣體擴散穿過血腦屏障和細胞膜及細胞器膜到達線粒體，具有明確的選擇性抗氧化等臟器保護作用。國內外研究表明［12-15］，呼吸氫氣或注射飽和氫氣生理鹽水均可通過抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用對大鼠腦缺血缺氧和腦創(chuàng)傷，以及對心臟、肺臟、腎臟I/R損傷產生明顯保護作用。本實驗采用電解水制取H2并直接腹腔注射，相比于呼吸氫氣或靜脈注射飽和氫氣生理鹽水效果更加確切，可控性更好。H2主要作用是選擇性清除自由基，減少ROS的產生。活性氧具有很強的氧化還原作用，可以和細胞的各種成分發(fā)生相互作用，引起一些膜和酶的功能改變［16］，尤其是線粒體膜損傷，導致細胞損傷，最終導致MPTP開放增加。所以應用氫氣治療后可以減少氧化應激的損害，從而使線粒體膜的破壞程度降低維持其完整性。實驗結果中，使用氫氣治療后與MOD組相比，ROS生成率明顯降低，膜電位明顯升高，MPTP開放度降低，線粒體腫脹度降低，起到了保護線粒體功能的作用。本研究同時引入缺損功能評分檢測，可以更直觀地分析大鼠I/R損傷線粒體功能下降后在行為上的變化，以及氫氣治療后在行為表現(xiàn)上的改善效果。

綜上所述，I/R同時腹腔注射純氫氣可改善大鼠I/R后的神經功能評分，對I/R損傷后的大鼠有明確的保護作用。其機制可能通過減少ROS生成，減輕氧化應激損傷，維持了線粒體膜完整性從而增強△ψm的穩(wěn)定性限制線粒體MPTP開放，進而維持線粒體結構完整及功能穩(wěn)態(tài)等有關。同時本研究僅從單方面分析了線粒體損傷的機制，存在許多不足，下一步將從細胞自噬方面來分析線粒體損傷的更多可能的機制。

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