余楊 付艷麗 孫翔

河南理工大學第一附屬醫(yī)院（河南省焦作市第二人民醫(yī)院）檢驗科（河南焦作 454100）

高危型人乳頭狀瘤病毒（HR?HPV）持續(xù)性感染是導致宮頸上皮內瘤變（CIN）及宮頸癌的主要病因，臨床上近100%的宮頸癌由HPV感染引起［1-3］。宮頸病變是漸慢演變可逆轉的過程，我國HPV的感染率為10%～15%，僅少數(shù)進展為CIN，0.35%罹患宮頸癌［4］，基于HR?HPV建立可進一步分選出高級別CIN和宮頸癌高危人群的合理篩查體系是目前研究的難點和重點。HPV感染后的疾病轉歸與機體免疫功能，龍其是與宮頸局部微環(huán)境免疫功能密切相關［5］。免疫抑制細胞構筑的免疫抑制微環(huán)境通過免疫耐受、免疫逃逸等機制促進宮頸病變的進展［6］，即使宮頸癌階段，腫瘤細胞處在快速生長階段或是晚期階段，機體內部仍存在抗腫瘤免疫反應，只因腫瘤免疫抑制微環(huán)境的控制無法發(fā)揮生物效用，由此可見免疫抑制微環(huán)境的重要性。調節(jié)性T細胞（Treg）是一群發(fā)揮免疫抑制功能獨特的輔助性T細胞亞群，叉頭翼狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）是Treg的特征性分子標志，通過多種方式對腫瘤免疫應答從啟動到效應的整個階段全程調控，在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。本實驗以HR?HPV持續(xù)感染所致宮頸病變的不同為切入點，監(jiān)測宮頸局部微環(huán)境HR?HPV DNA和CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平變化，分析HPV持續(xù)性感染和免疫系統(tǒng)相互作用的多樣表現(xiàn)，探討HR?HPV、Treg細胞、宮頸病變進程三者的聯(lián)系和發(fā)展趨勢，并進一步了解Treg細胞對宮頸病變進程或促進或抑制的雙向影響，為HR?HPV感染者更深入的分流診治提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2012年1月至2015年5月收治的HR?HPV持續(xù)性感染的不同宮頸病變病例，包括CINⅠ53例、CINⅡ55例、CINⅢ58例，宮頸鱗癌86例，慢性宮頸炎52例，均經(jīng)病理檢查確診。年齡34～55歲，中位年齡43.4歲，不同宮頸病變組的年齡無顯著差異，具有可比性。HR?HPV以16型、52型、58型為主，其次31型、33型，其余為少見分型，所有患者既往無免疫系統(tǒng)缺陷病史，近期未使用過免疫抑制類藥物。持續(xù)性HR?HPV感染定義為：HR?HPV感染者每6個月隨訪1次，在間隔6～12個月的相鄰2次隨訪中，同一患者的宮頸檢測樣本均顯示HR?HPV陽性且為同種類型［7-8］，隨訪持續(xù)時間均在2年以上。所有標本采集患者本人均知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 流式細胞儀采用美國BD FACS Calibur，配有BD CellQuest軟件。試劑：鼠抗人FITC?CD4單克隆抗體、鼠抗人PE?CD25單克隆抗體、鼠抗人PE?Cy5?Foxp3單克隆抗體均購自美國eBioscience公司。PCR擴增儀DA7600型和高危型HPV 核酸定量（16、18、31、33、45、52、56、58共8個型）檢測試劑盒均由中山大學達安基因公司提供。

1.3 方法

1.3.1 采用宮頸刷檢物制備宮頸病變單細胞懸液 用陰道窺器暴露宮頸，干棉球拭凈宮頸口過多的分泌物，觀察宮頸，將刷頭插入宮頸管，其中央較長的刷絲針對新鮮病變部位，順時或逆時針旋轉3～5圈，取下刷頭，并將其浸泡在含液基細胞學保存液的瓶中，300目尼龍網(wǎng)過濾雜質，取此保存液10 mL轉入15 mL試管，離心5 min（1 500 r/min），棄上清液，取2 mL沉淀液，以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗2～3次，500 r/min離心沉淀1～2 min，進行細胞計數(shù)，不少于106個。

1.3.2 流式細胞儀檢測單細胞懸液中Treg細胞 調整細胞濃度至1～2×107個/mL，用PBS洗滌、重懸，取上述細胞100 μL，加入FITC?CD4、PE?CD25各5 μL，混勻，室溫避光20 min，加冷固定破膜劑1 mL，4℃避光孵育30 min，加破膜緩沖液2 mL，洗滌2次，棄上清，加PE?Cy5?Foxp3抗體進行細胞內染色，4 h內進行流式細胞儀檢測。用空白管調節(jié)電壓，以CD25同型對照調節(jié)補償，確定CD4+CD25+細胞群，再以CD4+CD25+細胞設門，以Foxp3同型對照確定陽性信號，最后測定CD4CD25Foxp3管，檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞占CD4+細胞中的比值。

1.3.3 HPV DNA定量檢測 無菌條件下采用宮頸刷插入宮頸內，旋轉數(shù)周后停留片刻取出，將宮頸刷置入無菌管，采集的宮頸分泌物及時送檢或4℃保存，1周內檢測。DNA提取和PCR擴增按其說明書（PCR熒光法）進行具體操作。判斷標準：HPV?DNA ＞103copies/mL為陽性。根據(jù)HR?HPV核酸定量檢測的拷貝數(shù)分為4組：低載量組（104～105copies/mL）、中載量組（105～ 106copies/mL）、高載量組（106～107copies/mL）、超高載量組（＞107copies/mL）。

1.3.4 繪制HR?HPV DNA標準曲線 PCR熒光法閾值設定原則是值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點，且循環(huán)閾值（Ct）不出現(xiàn)任何數(shù)值。以4個濃度（1×103～1×106copies/mL）標準品的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。Ct值與樣本起始模板的拷貝數(shù)呈正相關，與起始模板拷貝數(shù)對數(shù)值間有嚴格的線性反比關系。

1.4 統(tǒng)計學處理 計量數(shù)據(jù)用±s表示，應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。病毒載量經(jīng)log轉換，多組間均數(shù)比較采用單變量兩因素主效應和交叉效應方差分析，進一步LSD?t檢驗進行多組均數(shù)的兩兩比較，選用簡單箱圖解析數(shù)據(jù)分布。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同宮頸病變和不同HR?HPV病毒載量CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達 見圖1、2。

圖1 不同病毒載量Treg細胞的表達差異Fig.1 Differential expression of Treg cells with different viral load

圖2 不同宮頸病變Treg細胞的表達差異Fig.2 Differential expression of Treg cells in different cervical lesions

慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌患者的Treg細胞中位數(shù)/四分位距依次為6.00%/1.00、6.00%/1.00、6.83%/2.05、8.00%/1.72和 9.00%/2.32，在慢性宮頸炎、CINⅠ共有4個溫和的異常值，其余病變組沒有異常值，宮頸癌組的數(shù)值分布最為分散，低病變組的數(shù)值分布更為集中。

低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者的Treg細胞中位數(shù)/四分位距依次為5.00%/1.00、6.00%/1.00、8.00%/1.36、10.00%/2.09，中載量組有1個溫和的異常值，其余組別沒有異常值，超高載量組的數(shù)值分布最為分散，中低載量組的數(shù)值分布更為集中。

2.2 不同宮頸病變和不同HR?HPV病毒載量的CD4+CD25+Foxp3+T細胞的表達差異比較 見表1和圖3。

表1 不同宮頸病變和不同HR?HPV病毒載量的CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達的方差比較Tab.1 The variance of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in different cervical lesions and different HR?HPV viral load

圖3 宮頸病變病毒載量兩因素交互效應的Treg細胞均值分布圖Fig.3 Mean distribution of Treg cells in two factor interaction effects on viral load and cervical lesions

整體方差分析顯示：宮頸局部Treg細胞Foxp3+表達在不同的宮頸病變、不同拷貝數(shù)的病毒載量之間的比較差異有統(tǒng)計學意義（F=24.93，109.86，P＜0.05），提示不同程度宮頸病變患者的Foxp3+表達水平不同，不同宮頸病變在不同病毒載量作用下Treg細胞的表達水平亦有很大變化，宮頸病變和病毒載量的交互作用顯著（F=3.39，P＜0.05），提示不同程度的宮頸病變和不同載量的病毒負荷除各自對Treg細胞有顯著的單獨影響外，在病變程度和病毒載量的不同組合上亦存在附加作用，且不同組別的宮頸病變患者Treg細胞的表達隨病毒載量的變化趨勢存在差異，遂再行進一步細化的兩兩比較：在5組不同程度病變的兩兩比較中，Treg細胞的表達水平在慢性宮頸炎和CINⅠ之間差異無顯著性（P＞0.05），其他組組間比較差異均有顯著性（P＜0.05）；在4組病毒載量的兩兩比較中，Treg細胞的表達水平在低載量和中載量之間差異無顯著性（P＞0.05），其余組別間差異均有顯著性（P＜0.05）。

圖3可見宮頸病變和HR?HPV病毒載量對Treg細胞表達存在交互影響作用，總體呈現(xiàn)隨著宮頸病變程度加重，級別增高，HR?HPV病毒負荷數(shù)升高，Treg細胞表達上升的趨勢，具體變化有：CINⅠ到CINⅡ，低和中載量組趨于平穩(wěn)，高載量組溫和升高，超高載量組持續(xù)上升，CINⅡ到CINⅢ中載量組變化不大，其余3組加速上升，CINⅢ到宮頸癌，中和超高載量組繼續(xù)上升，其余2組小幅上升，波動不大。

3 討論

HPV感染不是全身的，不通過血液傳播，宮頸局部免疫狀態(tài)和外周血反應的全身免疫狀態(tài)因微環(huán)境的差異不完全一致。目前普遍認為HR?HPV持續(xù)性感染與宮頸局部免疫微環(huán)境改變的協(xié)同疊加作用，促使宮頸癌發(fā)生［9］。免疫和炎癥是構成宮頸局部微環(huán)境的兩大基本特征，宮頸局部微環(huán)境浸潤大量免疫細胞，各種免疫細胞相互協(xié)調形成網(wǎng)絡共同維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)，一方面體現(xiàn)了機體免疫調控的精細化，通過自我調節(jié)維護過度自身免疫反應和有效免疫效應之間的平衡，這種調控機制貫穿免疫應答的全過程，另一方面提示機體免疫調控的復雜性。在宮頸病變發(fā)展過程中，抑制性細胞群體發(fā)揮著重要的負調節(jié)作用，通過免疫抑制控制炎癥范圍和強度。研究發(fā)現(xiàn)很多病變的早期，機體的全身免疫功能并未出現(xiàn)明顯的改變，但病變局部即已存在免疫抑制。Treg細胞正是具有免疫抑制特性的T細胞，無論體內還是體外，都具有強大的免疫抑制活性，可抑制非特異性免疫及特異性免疫，通過調節(jié)目標細胞的活化、增殖及細胞因子分泌等發(fā)揮作用［10］，在感染慢性遷延以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，文獻報道［11］，F(xiàn)oxP3+Treg表達強度與 HPV16基因組整合所致宮頸病變的惡性轉化關系密切。

對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析，以宮頸局部微環(huán)境Treg細胞表達水平為變量的方差分析顯示，宮頸病變和HR?HPV病毒載量兩因子之間存在交互效應（病變*病毒載量P＜0.05），交互均值分布輪廓圖（圖3）直觀地顯示了這一點，如果僅進行某一因素的單獨效應分析，不能展現(xiàn)Treg細胞在不同因素聯(lián)合作用下的表達特點和規(guī)律。宮頸病變的不同程度和HR?HPV病毒的不同載量對宮頸局部微環(huán)境Treg細胞表達均有影響，整體差異有顯著（均P＜0.05），兩兩比較：Treg細胞的表達水平在慢性宮頸炎和CINⅠ之間、低載量和中載量之間差異均無顯著性（P＞0.05），其他組組間差異均有顯著性（P＜0.05）。同等程度的宮頸病變在高和超高病毒載量時Treg細胞高表達，超高病毒載量時達高峰，同一病毒載量組別在高級別CIN（CINⅡ+）和宮頸癌Treg細胞表達水平較高，宮頸癌時達到高峰。進一步細化比較發(fā)現(xiàn)：Treg細胞均數(shù)在宮頸癌和超高病毒載量組群波動范圍大，在低度病變和低載量時波動幅度小，推測宮頸惡性癌變和超高的病毒載量在Treg細胞表達上發(fā)揮了更大和更為復雜的作用，在不同程度的宮頸病變、不同拷貝數(shù)的HPV病毒載量中Treg細胞表達量及其發(fā)揮的功能和由此產(chǎn)生的重要作用并不相同。Treg的免疫抑制作用在HR?HPV相關性宮頸病變的進程變化中，可能具有雙向調節(jié)作用：（1）對HPV誘導的持續(xù)炎癥刺激形成保護性生理防御反應，在防止過強的免疫損傷和清除病原體之間維持平衡，以減緩組織病理損害；（2）免疫逃逸導致機體對腫瘤的免疫無應答或免疫反應低下，促使宮頸癌變。結合本實驗研究，Treg細胞在程度較低的宮頸病變和低拷貝的病毒載量時，作用較一致，其表達水平的升高更多是一種應激性保護防御反應的正向作用，提示Tregs細胞在病毒感染過程中可使組織損傷程度最小化［12］，致使HR?HPV感染雖持續(xù)存在，但患者病情較輕。Treg細胞在CINⅢ/宮頸癌和高/超高拷貝的病毒載量時，三者之間有較大的不一致表現(xiàn)，呈現(xiàn)較復雜和特殊的組合模式：（1）CINⅢ/宮頸癌+低載量+Treg細胞較高表達量；（2）CINⅢ/宮頸癌+中載量+Treg細胞較高表達量；（3）CINⅢ/宮頸癌+高/超高載量+Treg細胞較低表達量等，考慮可能原因有：（1）高病毒載量時T細胞耗竭；（2）病毒載量與病毒整合率不盡相同；（3）病變進展到重度CIN和宮頸癌程度后，細胞的惡性轉化不再依賴HR?HPV的高載量；（4）HR?HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，而非充分條件。由此推測，隨著CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞在CD4+T細胞占比的增加，T細胞及各亞群細胞間比例失衡，宮頸微環(huán)境免疫抑制加重，干擾機體對HPV復制的免疫控制，病毒大量復制，感染持續(xù)存在日漸嚴重，打破了機體微環(huán)境抗癌/促癌的內在平衡，加劇宮頸病變從宮頸炎→CIN→宮頸癌的順向發(fā)展，由此可見免疫抑制在整個病變鏈條中的重要作用，與文獻報道宮頸癌的免疫狀態(tài)為免疫耐受或免疫逃逸一致［13］。

總之，HR?HPV持續(xù)感染是宮頸病變進展惡化的首要條件，宮頸局部微環(huán)境免疫失衡是關鍵環(huán)節(jié)，宮頸局部Treg細胞、宮頸病變、HR?HPV病毒載量三者同向變化中存在差異性波動，即使宮頸癌階段也非完全同步，這反映了人體免疫系統(tǒng)與HPV感染之間抗衡的多樣性和復雜性。因此，從宮頸局部微環(huán)境入手，改善被HPV干擾和破壞的生理狀態(tài)，兼顧正相和負向調控機制，維持機體最為適當?shù)目鼓[瘤免疫應答，為高級別CIN和宮頸癌的防護提供新思路。

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