于亞婷 段斯亮 馬新博 申海光 劉云 姜伯勁 周盛 肖立兵 韋麗華

廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院1病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，2病理學(xué)教研室（廣西柳州545005）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，臨床進程發(fā)展迅速，預(yù)后不良。目前，肝癌的傳統(tǒng)治療手段主要是手術(shù)切除、化療，放療等［1-2］，然而，這些治療方法給患者的生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重的影響，因此，如何更好地預(yù)防或治療肝癌是迫切需要解決的問題。

以腫瘤細(xì)胞和同種樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的融合細(xì)胞制備而成的腫瘤疫苗，因其具備很好的免疫原性，成為針對惡性腫瘤治療開發(fā)的新一代治療性腫瘤疫苗［3-4］。WENG等［5］在慢性淋巴細(xì)胞白血病的研究中，對于腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC、DC負(fù)載凋亡腫瘤細(xì)胞和融合細(xì)胞這三者進行了比較，發(fā)現(xiàn)只有融合細(xì)胞表現(xiàn)出最強的誘導(dǎo)能夠發(fā)揮細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞的能力。GONZáLEZ等［6］比較了融合疫苗和裂解物或是肽來源的DC疫苗，發(fā)現(xiàn)融合疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生更多腫瘤特異性T細(xì)胞，從而使得機體IFN?γ水平升高更加明顯。由此可見，DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗在刺激機體抗腫瘤方面具有其自身獨特的優(yōu)勢。

如何制備安全高效的融合細(xì)胞疫苗依舊是融合細(xì)胞疫苗發(fā)展和應(yīng)用道路上一個需要探討和解決的問題。目前，制備融合細(xì)胞疫苗的常用方法是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）誘導(dǎo)融合法［7-9］。采取PEG融合法進行融合細(xì)胞疫苗的制備費用較電融合法較低［10-12］。為了提高融合細(xì)胞疫苗安全性，常需采用輻照的方法對腫瘤細(xì)胞或者腫瘤融合細(xì)胞進行照射［13-14］。為此，筆者在本實驗的研究中，探討了輻照劑量對腫瘤細(xì)胞活性的影響，并制備安全高效的融合細(xì)胞疫苗實現(xiàn)更強的殺傷肝癌細(xì)胞的效果，為腫瘤細(xì)胞疫苗制備奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物和細(xì)胞 4～6周齡雌性BALB/c小鼠，購買于北京維通利華有限公司。鼠肝癌細(xì)胞系BNL 1ME a.7R.1（MEAR）細(xì)胞購買于上海生物細(xì)胞庫。T淋巴細(xì)胞與DC分別取自小鼠的脾臟和骨髓。

1.2 主要試劑 PEG（美國，Sigma Aldrich），PKH?26（美國，Sigma Aldrich），Annexin V/PI凋亡檢測試劑（瑞士，Roche）。

1.3 主要儀器 生物安全柜（蘇凈集團，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司），超低溫冰箱（中國海爾公司），RS2000生物學(xué)X射線輻照儀（美國Rad Source公司），流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司），倒置顯微鏡（上海巴拓儀器有限公司）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 用1640培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和10%FBS），進行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞輻照方法 輻照的前1天將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，接種量為3×105個/瓶。直接在25 cm2的培養(yǎng)瓶中進行X射線的輻照。輻照儀為RS 2000生物學(xué)X射線輻照儀。輻照電流為16 mA，電壓為250 kV。輻照劑量為：5、10、20、40、60 Gy；并設(shè)置空白對照組，不進行輻射。劑量率為1 Gy/min。

1.4.3 細(xì)胞活性檢測 將接受不同輻照劑量的細(xì)胞接種于平板，通過統(tǒng)計細(xì)胞克隆形成數(shù)，進行細(xì)胞活性檢測。細(xì)胞接種存活率即為細(xì)胞克隆形成率，表示接種的貼壁細(xì)胞后存活并形成克隆的數(shù)量，從而反映細(xì)胞的群體依賴性和增殖的能力。具體方法為：用胰酶將接受不同輻照劑量的細(xì)胞分別消化下來，計數(shù)，然后調(diào)整細(xì)胞懸液至適宜濃度，再分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，在5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)1周左右，固定、染色并干燥。統(tǒng)計細(xì)胞的克隆數(shù)，每個劑量設(shè)3個皿作為重復(fù)。最后，計算出細(xì)胞克隆的形成率，得出不同劑量輻照以后的腫瘤細(xì)胞活性情況。計算公式：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=（受照細(xì)胞克隆形成率/對照細(xì)胞克隆形成率）×100%。

1.4.4 細(xì)胞融合方法 收集培養(yǎng)5 d的原代DC及經(jīng)20、60 Gy照射的MEAR細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)。按DC與MEAR之比為2∶1，渦旋混勻細(xì)胞，離心后棄上清，彈勻細(xì)胞，于40℃水浴。取300 μL PEG緩慢加入離心管中。緩慢沿管壁加入一定量的PBS，輕搖離心管至混勻，離心1 500 r/min，10 min。用含完全1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.5 流式檢測不同輻照劑量下DC/MEAR融合細(xì)胞疫苗體外對MEAR細(xì)胞的殺傷作用 將分離好的淋巴細(xì)胞與20、60 Gy輻照劑量下DC/MEAR融合細(xì)胞疫苗按10∶1的比例混勻后，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1周。收集一定數(shù)量的MEAR細(xì)胞，PBS洗1次，離心后進行PKH?26染色。收集經(jīng)融合細(xì)胞疫苗刺激后的T淋巴細(xì)胞，按效靶比10∶1鋪板。孵育4～6 h后，收集上述細(xì)胞，PBS洗1次，進行PI染色。染色完畢，進行流式檢測。按以下公式計算細(xì)胞的凋亡率，并比較各實驗組MEAR細(xì)胞的凋亡情況。MEAR細(xì)胞的凋亡率=100%×（實驗孔的凋亡率-自然釋放孔的凋亡率）/（100-自然釋放的孔凋亡率）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 利用Graph pad軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間的比較應(yīng)用LSD檢驗法，多組數(shù)據(jù)之間的比較應(yīng)用F檢驗法。

2 結(jié)果

2.1 輻照劑量對腫瘤細(xì)胞活性的影響 經(jīng)不同劑量的X射線輻照以后，MEAR細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)隨著輻照劑量的上升而減少（圖1）。通過對所取得的數(shù)據(jù)點進行擬合，可得到MEAR細(xì)胞的存活曲線（圖2）。細(xì)胞的存活曲線描述了細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)與輻照劑量之間的關(guān)系。我們得出，當(dāng)輻照劑量約為20 Gy時，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為50%；當(dāng)輻照劑量為60 Gy的時候，細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)較低。

2.2 輻照劑量對融合細(xì)胞疫苗效果的影響 應(yīng)用PKH?26/PI的方法檢測不同輻照劑量（20和60 Gy）下制備的融合細(xì)胞疫苗，刺激T淋巴細(xì)胞，對MEAR細(xì)胞的殺傷效果的比較。用PKH?26進行MEAR細(xì)胞的標(biāo)記。MEAR細(xì)胞的平均凋亡率為18.1%、38.0%。20 Gy組DC/MEAR誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞對靶細(xì)胞MEAR殺傷率高于60 Gy組（圖3）。兩組結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。殺傷實驗結(jié)果提示，融合細(xì)胞疫苗能刺激產(chǎn)生MEAR特異性T淋巴細(xì)胞（CTL），且20 Gy組DC/MEAR誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞對MEAR細(xì)胞的殺傷活性更強。

圖1 經(jīng)不同劑量的X射線輻照后MEAR細(xì)胞克隆數(shù)隨輻照劑量增加而減少Fig.1 The number of MEAR cell clones were decreased with the increasing of X?Ray irradiation dose

圖2 經(jīng)不同劑量的X射線輻照以后，MEAR細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)隨著輻照劑量的增加而減少Fig.2 The survival percent of MEAR cells was decreased with the increasing of X?Ray irradiation dose

圖3 不同輻照劑量下制備的融合細(xì)胞疫苗刺激產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞，對MEAR細(xì)胞的殺傷效果不同F(xiàn)ig.3 The killing effects of T lymphocytes，which were stimulated by different fusion cell vaccines，to MEAR cells was not the same.These fusion cell vaccines were made from distinct dose irradiated tumor cells

圖4 DC/MEAR?T（60 Gy）組和DC/MEAR?T（20 Gy）組T淋巴細(xì)胞對MEAR細(xì)胞的殺傷效果比較Fig.4 mDC/MEAR?T（60 Gy）group and DC/MEAR?T（20 Gy）group were significantly different in aspect of T lymphocytes′killing effects to MEAR cells

3 討論

DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗的最大優(yōu)勢在于其無需鑒定已知和未知的腫瘤抗原和腫瘤基因，也無需明確腫瘤抗原和腫瘤基因的特異性和非特異性。DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗既保持了DC遞呈抗原的特點，又保持了腫瘤細(xì)胞作為免疫原的性質(zhì)，DC通過其表面的MHC?I和MHC?II類分子遞呈已知或未知的腫瘤抗原，進而誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞，發(fā)揮免疫效應(yīng)［15-16］。至今，關(guān)于輻照劑量對細(xì)胞存活的影響的研究并不多，但是，已有一些報道闡述了關(guān)于單次照射和分次照射對細(xì)胞存活的影響。科學(xué)家認(rèn)為，單次大劑量輻照可能會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生不可修復(fù)的損傷。我們猜測，對腫瘤細(xì)胞進行適當(dāng)劑量的輻照，能夠在保證其免疫原性不被破壞的同時，使其喪失大量增殖的能力，從而提高了腫瘤融合細(xì)胞疫苗的安全性。本實驗為探索不同輻照劑量下用于制備融合疫苗的腫瘤細(xì)胞存活情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低，這可能是與腫瘤細(xì)胞經(jīng)輻照后結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。這樣經(jīng)過大劑量輻照的腫瘤細(xì)胞只具有免疫原性，不具有增殖活性，但是，過高的劑量會使腫瘤細(xì)胞免疫原性降低，所以，以合適的劑量對腫瘤細(xì)胞照射，從而制備的腫瘤融合細(xì)胞疫苗具備安全高效的特性，這個探索不僅為DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備提供了參考依據(jù)，同時，也為DC/腫瘤融合細(xì)胞疫苗的臨床應(yīng)用提供了廣闊前景。當(dāng)然，對于輻照劑量如何影響腫瘤細(xì)胞活性，進而影響腫瘤融合細(xì)胞疫苗效果的機制還有待進一步研究。

參考文獻

［1］陳昭光，任輝，張佳斌，等.術(shù)前天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶血小板比值對肝細(xì)胞癌切除術(shù)預(yù)后的分析［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（11）：1814?1818.

［2］WANG J，HUANG F，HUANG J，et al.Epigenetic analysis of FHL1 tumor suppressor gene in human liver cancer［J］.Oncol Lett，2017，14（5）：6109?6116.

［3］ZHANG Y，LUO W，WANG Y，et al.Enhanced antitumor im?munity of nanoliposome?encapsulated heat shock protein 70 pep?tide complex derived from dendritic tumor fusion cells［J］.On?col Rep，2015，33（6）：2695?2702.

［4］HU Z，CHEN J，ZHOU S，et al.Mouse IP?10 gene delivered by folate?modified chitosan nanoparticles and dendritic/tumor cells fusion vaccine effectively inhibit the growth of hepatocellu?lar carcinoma in mice［J］.Theranostics，2017，7（7）：1942?1952.

［5］WENG D，CALDERWOOD S K，GONG J.Preparation of a heat?shock protein 70?based vaccine from DC?tumor fusion cells［J］.Methods Mol Biol，2011，787：255?265.

［6］GONZáLEZ F E，GLEISNER A，F(xiàn)ALCóN?BEAS F，et al.Tu?mor cell lysates as immunogenic sources for cancer vaccine de?sign［J］.Hum Vaccin Immunother，2014，10（11）：3261 ?3269.

［7］GERISCH G，ECKE M，NEUJAHR R，et al.Membrane and actin reorganization in electropulse?induced cell fusion［J］.J Cell Sci，2013，126（9）：2069?2078.

［8］KANDU?ER M，U?AJ M.Cell electrofusion：past and future perspectives for antibody production and cancer cell vaccines［J］.Expert Opin Drug Deliv，2014，11（12）：1885?1898.

［9］NIERKENS S，JANSSEN E M.Harnessing dendritic cells for tumor antigen presentation ［J］.Cancers（Basel），2011，3（2）：2195?2213.

［10］ZHANG Y，LUO W，WANG Y，et al.Purified dendritic cell?tumor fusion hybrids supplemented with non?adherent dendritic cells fraction are superior activators of antitumor immunity［J］.PLoS One，2014，9（1）：e86772.

［11］DANNULL J，TAN C，F(xiàn)ARRELL C，et al.Gene expression profile of dendritic cell?tumor cell hybrids determined by micro?arrays and its implications for cancer immunotherapy［J］.Im?munol Res，2015，2015：789136.

［12］KOIDO S，HOMMA S，TAKAHARA A，et al.Immunologic monitoring of cellular responses by dendritic/tumor cell fusion vaccines［J］.Biomed Biotechnol，2011，2011：910836.

［13］CHEN X，LIU Z，HUANG Y，et al.Superior anti?tumor protec?tion and therapeutic efficacy of vaccination with dendritic cell/tumor cell fusion hybrids for murine Lewis lung carcinoma［J］.Autoimmunity，2014，47（1）：46?56.

［14］MCCONNELL E J，PATHANGEY L B，MADSEN C S，et al.Dendritic cell?tumor cell fusion and staphylococcal enterotoxin B Treatment in a Pancreatic Tumor Model［J］.J Surg Res，2002，107（2）：196?202.

［15］KUMAR C，KOHLI S，BAPSY P P，et al.Immune modulation by dendritic?cell?based cancer vaccines［J］.Biosci，2017，42（1）：161?173.

［16］LIM S，KOO J H，CHOI J M.Use of cell?penetrating peptides in dendritic cell?based vaccination［J］.Immune Netw，2016，16（1）：33?43.