張 杉,肖 娟,宋曉慧,熊利芝

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

自然界中植物含有許多對人類身心有益的活性物質(zhì)，魁蒿中的黃酮就是其中頗具功效的一種.魁蒿(ArtemisiaprincepsPamp.)，菊科，蒿屬，多年生全國廣布性草本植物.味辛苦，民間常用藥，有止血、消炎等功效，對婦科疾病也有很好的功效[1].適當攝入黃酮能夠降低癌癥、骨質(zhì)疏松癥[2-3]等疾病的發(fā)病率.目前提取黃酮的方法[4-6]有很多，各有優(yōu)劣.近年來，在植物內(nèi)含物提取方面，超聲波提取技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛.效率高、不易破壞有效成分[7]是超聲波提取技術(shù)的顯著特點，因此運用超聲波技術(shù)提取植物內(nèi)含物可以增大活性物質(zhì)進入溶劑的速度，既縮短提取時間，又增加提取率.目前，通過超聲波技術(shù)提取魁蒿總黃酮還未見報道，本次實驗主要以超聲波技術(shù)提取魁蒿總黃酮，以響應(yīng)面的方法探討并優(yōu)化提取工藝.

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

魁蒿：取樣于吉首大學(xué)周邊地區(qū).選取葉片完整的魁蒿，蒸餾水洗凈后晾干，50 ℃烘干，粉粹過40目篩，保存?zhèn)溆?試劑：蘆丁(上海阿拉丁工業(yè)有限公司，純度大于98.0%)；無水乙醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司，純度大于99.7%)；NaNO2(成都金山化學(xué)試劑有限公司，純度大于99.0%)；Al(NO3)3(成都金山化學(xué)試劑有限公司，純度大于99.0%)；NaOH(天津石英鐘廠霸州市化工廠，純度大于96.0%).

1.2 儀器

儀器：T6新世紀型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDZ4型臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司).

2 實驗方法

2.1 標準曲線制作

采用5% NaNO2-10% Al(NO3)3-4% NaOH法[8]制作，得標準曲線方程Y=10.335X-0.003 8，R2=0.999 4.其中：Y為吸光度；X為黃酮質(zhì)量濃度，單位g·L-1.

2.2 總黃酮的提取

取不同體積分數(shù)的乙醇提取劑置于裝有適量樣品的錐形瓶中，于超聲清洗器中提取，離心后取上層清液定容，即得提取液.

2.3 總黃酮的測定

將提取液稀釋數(shù)倍，按照標準曲線制作的方法測定，得其吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算提取液濃度.參照文獻[9]計算魁蒿總黃酮提取率.

2.4 單因素實驗

按次序研究料液比等5個因素對魁蒿總黃酮提取率的影響，實驗內(nèi)容見表1.

表1 單因素Table 1 Single Factors

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

從單因素實驗中選取影響較大的因素進行響應(yīng)面實驗[10]，按DE軟件分析得出最適工藝條件.

2.6 重復(fù)驗證實驗

用DE實驗設(shè)計軟件分析實驗結(jié)果得出最佳工藝，并進行3次平行實驗.

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗

圖1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of Ethanol Volume Fraction on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在溫度為55 ℃、功率為200 W、時間為30 min和料液比為1∶20(g∶mL)的條件下，按表1中因素Ⅰ次序依次加入不同體積分數(shù)溶劑提取.結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，在乙醇體積分數(shù)大于40%且小于70%時，乙醇體積分數(shù)越高，總黃酮提取率越大；但當乙醇體積分數(shù)大于70%時，總黃酮提取率降低.這可能是魁蒿總黃酮極性[11]與乙醇體積分數(shù)70%的溶液極性接近的原因，因而選體積分數(shù)70%的乙醇溶液為魁蒿提取的總黃酮的提取液.

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of Material-to-Liquid Ratio on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在溫度55 ℃、功率200 W、時間30 min和乙醇體積分數(shù)70%的條件下，按表1中因素Ⅱ次序依次以不同料液比提取.實驗結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，總黃酮提取率在料液比為1∶20(g∶mL)時提取率最高，在料液比小于1∶20(g∶mL)時呈上升趨勢，此后呈下降趨勢.這可能與促進黃酮析出的質(zhì)子推動力有關(guān)[11]，在料液比為1∶15至1∶20(g∶mL)之間質(zhì)子推動力較大，因此提取率升高.在料液比低于1∶20(g∶mL)時，總黃酮提取率降低，這可能與提取液中滲透壓有關(guān)[12]，由于細胞外料液比下降致使?jié)B透壓降低，從而導(dǎo)致總黃酮析出率下降.

圖3 超聲功率對總黃酮提取的影響Fig.3 Effect of Ultrasonic Power on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.3 提取功率對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在溫度55 ℃、時間30 min、乙醇體積分數(shù)70%和料液比為1∶20(g∶mL)的條件下，分別按表1的因素Ⅲ不同水平下依次提取.實驗結(jié)果如圖3所示.從圖3可知，總黃酮提取率隨超聲功率的變化趨勢呈單峰狀，于200 W達極大值，左側(cè)呈上升趨勢，右側(cè)呈下降趨勢.一定功率的超聲波能夠增加魁蒿細胞的破碎程度[13]，增加總黃酮析出率.但總黃酮析出的同時其他物質(zhì)的析出也增加，因而使細胞內(nèi)外滲透壓改變，當超聲功率超過一定值時反而使總黃酮析出率降低.

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of Temperature on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.4 提取溫度對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在乙醇體積分數(shù)為70%、料液比為1∶20(g∶mL)、時間30 min和超聲功率200 W的條件下，按表1因素Ⅳ的次序提取.實驗結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，在35～65 ℃之間，溫度升高，總黃酮提取率增大，但溫度高于65 ℃時反而減小.溫度影響細胞的滲透壓和溶質(zhì)的擴散，在低于最適溫時，溫度的升高能夠提高細胞的滲透壓，加速溶質(zhì)的擴散[13].本試驗中，在35～65 ℃之間，溫度的升高加速總黃酮的滲透，增加溶解速度，提高析出率.但溫度超過最適溫度65 ℃時，黃酮中某些物質(zhì)易被氧化[13]，因而降低了提取率.

圖5 時間對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of Time on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.5 提取時間對總黃酮提取率的影響 分別準確稱取1 g魁蒿粗粉置于5個錐形瓶，在乙醇體積分數(shù)為70%、料液比為1∶20(g∶mL)、超聲功率200 W和溫度65 ℃的條件下，分別對魁蒿粉末按表1因素Ⅴ的水平次序提取，測定吸光值并計算提取率.實驗結(jié)果如圖5所示.圖5表明，魁蒿總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高而后降低；提取40 min時總黃酮提取率達到極大值；提取時間超過40 min后總黃酮提取率隨著提取時間的延長而下降.物質(zhì)提取過程中，有用物質(zhì)析出的同時會釋放相關(guān)分解酶[13].本實驗中，提取時間超過40 min時，可能某些能夠降解黃酮物質(zhì)的酶增加，降解了黃酮，總黃酮提取率下降.

3.2 響應(yīng)面分析

3.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計表 響應(yīng)面四因素三水平實驗設(shè)計如表2所示.

表2 響應(yīng)面四因素三水平實驗設(shè)計Table 2 Design of 4-Factors and 3-Level Experiment by in Response Surface Methodology

3.2.2 響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)結(jié)果 以上述各單因素中影響較大的因素作為實驗自變量，魁蒿總黃酮提取率作為實驗因變量，進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗.實驗結(jié)果列于表3.

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 3 Experimental Results by Response Surface Methodology

3.2.3 響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)方差分析 用DE設(shè)計軟件分析表3實驗結(jié)果的方差，結(jié)果見表4.

表4 方差分析Table 4 Variance Analysis

注：①表示p<0.001極顯著;②表示0.001

方差分析中，失擬項顯著性反應(yīng)模型選擇是否良好：失擬項顯著表示不能用此模型進行預(yù)測，模型選擇有誤，反之則模型選擇良好.[10]

表4中，p模型<0.000 1，說明該模型擬合程度較好，能夠很好地預(yù)測本次實驗最佳理論數(shù)值.因素平方項A2、B2、C2、D2和單因素項A對總黃酮影響顯示為極顯著，說明其對實驗?zāi)繕擞绊憳O大；單因素項B、C、D和兩因素相互作用項BD、CD顯示顯著，說明其對實驗?zāi)繕擞绊戄^大；AB及AC表現(xiàn)為無顯著性，說明其對響應(yīng)值影響效果不明顯.從上述對因素影響效果的方差分析可知，魁蒿總黃酮提取率受所選因子影響次序從大到小依次為料液比、超聲功率、提取溫度和提取時間.

經(jīng)過回歸擬合得出擬合方程[14]:

黃酮提取率/%=2.494+0.041A-0.027B+0.027C-0.024D-0.012AB+0.002AC-0.026AD+0.032BC+0.044BD-0.051CD-0.320A2-0.140B2-0.250C2-0.270D2.

3.2.4 響應(yīng)面對總黃酮提取影響的曲面分析 交互因素曲面分析如圖6—11所示.

圖6 料液比及溫度對總黃酮提取率的響應(yīng)曲面Fig.6 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Extraction Temperature

圖7 料液比及時間對總黃酮提取率的響應(yīng)曲面Fig.7 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Extraction Time

圖8 料液比及功率對總黃酮提取率的響應(yīng)曲面Fig.8 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Ultrasonic Power

圖9 溫度及時間對總黃酮提取率的響應(yīng)曲面Fig.9 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Temperature and Time

圖10 溫度及功率對總黃酮提取率的響應(yīng)曲面Fig.10 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Temperature and Ultrasonic Power

圖11 時間及功率對總黃酮提取率的響應(yīng)曲面Fig.11 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Time and Ultrasonic Power

響應(yīng)面的曲面陡峭程度能反映出因素對考察值影響顯著程度，曲面越陡峭代表影響越顯著[15].圖6—11響應(yīng)曲面顯示，四因素的交互影響[16]中，料液比與時間的共同作用對總黃酮提取率效果相對較小；時間與功率則相較強；其他因素的交互效果均具顯著性差異.結(jié)合方差分析可以看出，曲面分析和方差分析沒有顯著差別.

實驗得出理論最優(yōu)條件：乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度和超聲功率分別為70%，1∶20.35(g∶mL)，51 min，65.06 ℃和201.5 W，提取率為2.499%.結(jié)合實驗具體情況將條件稍作修改：乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶20(g∶mL)、提取時間50 min、提取溫度65 ℃和超聲功率200 W.平行重復(fù)實驗結(jié)果為2.505%，2.486%和2.488%.總黃酮平均提取率為2.493%.

4 結(jié)論

經(jīng)過超聲波輔助提取以及對實驗結(jié)果的方差分析，得出魁蒿總黃酮提取率受所選因子影響次序從大到小依次為：料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間.響應(yīng)面法分析得出最佳工藝條件為：料液比1∶20(g∶mL)、乙醇體積分數(shù)70%、提取時間50 min、提取溫度65 ℃和超聲功率200 W.在此工藝條件下，最大提取率達到2.493%.

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