任本洪， 孫雪嬌， 郝躍鵬， 寇俊婷， 牛仕詩， 楊成園， 王曉霞

(山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 山西 太原 030001)

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病率高、侵襲性高、易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，死亡率居全球惡性腫瘤第2位，僅次于肺癌[1]。肝癌具有高復(fù)發(fā)的特點，有研究表明，肝癌術(shù)后1年和2年復(fù)發(fā)率分別為42.8%和38.8%[2]；5年復(fù)發(fā)率可達60%左右[3]。因此，對肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機制進行深入研究，尋求有效抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的藥物已成為當今肝癌研究的一個方向。

Aurora蛋白激酶是近年來發(fā)現(xiàn)的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 由Aurora A、B和C 3個成員組成，它們在催化結(jié)構(gòu)域中具有67%～76%的氨基酸序列同一性，僅僅在NH2末端有所不同[4]，分別發(fā)揮著不同的生物功能。近年來研究表明，在卵巢癌[5]、胃癌[6]和乳腺癌[7]中均存在Aurora激酶的高表達。研究Aurora激酶在腫瘤細胞中的作用機理，對研發(fā)腫瘤靶向藥物具有重要的臨床意義。例如AZD-1152(barasertib)、MLN-8237(alisertib)和VX-680(tozasertib)[8]幾個Aurora蛋白激酶抑制劑已步入臨床試驗階段。據(jù)報道，VX-680能夠與Aurora蛋白激酶結(jié)合使Aurora A和B激酶的活性降低[9]，導(dǎo)致細胞分裂停止和細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長。然而關(guān)于VX-680對HepG2細胞間黏附能力及遷移能力的影響，目前尚未見文獻報道。因此，本研究將有助于闡明VX-680 的作用機制，從而為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 人肝癌細胞系HepG2由山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存。

1.2主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)基購于HyClone；瓊脂粉購于北京索萊寶有限公司；VX-680購于Merck，用DMSO溶解并貯存。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 將HepG2細胞用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

2.2細胞緩慢聚集實驗[10]取對數(shù)生長期細胞消化傳代于培養(yǎng)皿中，待細胞長至70%左右時，分別向其中加入不同濃度(3.125 μmol/L，6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)的VX-680，放于孵箱中孵育48 h；消化細胞并加入提前用瓊脂鋪好的96孔板中，每組設(shè)置5個平行孔，在孵箱中孵育12 h，觀察細胞聚集情況，拍照并計算各組形成的細胞團數(shù)。

2.3細胞分離實驗[11]取對數(shù)生長期的細胞消化傳代于培養(yǎng)皿中，待細胞長至70%左右時，加入不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)的VX-680作用48 h；常規(guī)消化細胞于48孔板中鋪板，每組設(shè)置10個平行孔，待細胞長滿時，分別用含1 mmol/L EDTA(TE)的0.2%胰酶及1 mmol/L CaCl2(TC)的0.2%胰酶處理細胞，于倒置顯微鏡下計數(shù)單個細胞和細胞團總數(shù)(N)，并用 NTC/NTE值來表示細胞分散程度。

2.4劃痕愈合實驗 常規(guī)消化不同濃度 (3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L) VX-680作用24 h后的HepG2細胞，使其濃度為1×109/L，接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合長滿后，用200 μL移液槍槍頭在單層細胞上呈“一”字垂直劃痕，用PBS洗2次，然后加入無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后取出，倒置顯微鏡觀察并拍照，采用Image-Pro Plus軟件測量劃痕寬度。

2.5Western blot 檢測蛋白的表達水平 收集對數(shù)生長期細胞加入含有PMSF的細胞蛋白裂解液，冰上裂解40 min，每隔10 min輕彈1次，以防結(jié)冰，12 000 r/min 離心20 min收集上清液，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。采用 SDS-PAGE 進行蛋白分離后，轉(zhuǎn)至0.45 μm NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入稀釋好的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和β-actin Ⅰ抗，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜3次，加入相應(yīng)的 Ⅱ 抗室溫搖床孵育2 h，PBST洗膜3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光成像。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細胞聚集實驗結(jié)果

隨著VX-680濃度的增加，細胞聚集形成的細胞團塊數(shù)減少，體積增大，團塊越來越致密；而對照組細胞聚集形成的團塊較多，體積較小，且疏松。通過計數(shù)每組的細胞團數(shù)，發(fā)現(xiàn)對照組所形成的細胞團塊數(shù)為63.67±7.2，而實驗組不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680所形成的細胞團塊數(shù)分別為24.67±3.5、14.0±3.0和1.3±0.6，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且各實驗組間差別亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明實驗組HepG2細胞間的細胞聚集能力明顯高于對照組，并且聚集能力隨VX-680濃度的增加逐漸增強，見圖1。

Figure 1. Aggregation ability of HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations observed under inverted microscope. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖1不同濃度VX-680作用HepG2細胞后的細胞聚集情況

2 細胞分離實驗結(jié)果

用含1 mmol/L EDTA的胰酶處理后，VX-680各濃度組的HepG2細胞大多分散成單個，各組細胞的分散程度幾乎沒有差異；用含1 mmol/L CaCl2的胰酶處理后，與對照組相比，隨著VX-680濃度的增加，實驗組所形成的細胞團塊越來越大。經(jīng)計算，對照組NTC/NTE值為(0.90±0.13)；而不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680處理組NTC/NTE比值分別為0.48±0.07、0.34±0.03和0.19±0.01，與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且各實驗組間差別亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，實驗組細胞間的細胞黏附能力明顯強于對照組，并且黏附能力隨著VX-680濃度的增加逐漸增強，細胞越來越不容易被分散，見圖2。

3 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力的變化

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，劃痕后0 h，對照組和VX-680各濃度組的劃痕寬度基本相同，48 h后，對照組的劃痕基本愈合，而VX-680各濃度組細胞的劃痕愈合延遲，并且隨著VX-680濃度的升高，細胞劃痕的愈合能力逐漸降低，與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且各實驗組間差別亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明VX-680能夠抑制HepG2細胞的遷移，見圖3。

4 Western blot檢測VX-680的HepG2細胞中黏附分子E-cadherin的蛋白表達水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，DMSO和不同濃度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680作用于HepG2細胞24 h后，細胞中E-cadherin蛋白的表達水平隨著VX-680濃度的增加而升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

討 論

Aurora激酶在大多數(shù)惡性腫瘤中均存在高表達，如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌和胰腺癌等。Aurora激酶的過表達可以促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡。VX-680可以抑制Aurora激酶的活性，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。

Figure 2. Dissociation of the HepG2 cells treated with different concentration of VX-680. A: the dissociation ability of the HepG2 cells detected by the method of exposure to trypsin in the presence of EDTA or CaCl2(×200); B: the cell dissociation index (NTC/NTE). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖2不同濃度VX-680作用的HepG2細胞分離情況

Figure 3. The effects of VX-680 at different concentrations on the migration ability of HepG2 cells. A: the representative pictures of wound healing assay (×100); B: the scratch width of HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖3不同濃度的VX-680對HepG2細胞遷移的影響

Figure 4. The protein levels of E-cadherin in the HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vs3.125 μmol/L group;#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

圖4不同濃度的VX-680作用下HepG2細胞中E-cadherin蛋白表達水平

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展往往與細胞行為的改變有關(guān)。大量的研究顯示，腫瘤細胞間黏附力的下降是造成腫瘤細胞發(fā)生遷移和轉(zhuǎn)移的首要原因，鈣黏蛋白是一類主要介導(dǎo)細胞間同質(zhì)黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，其中上E-cadherin能以嗜同性方式(同種分子間拉鏈式結(jié)合)介導(dǎo)同型細胞與細胞間的黏附。當E-cadherin失活時，可以促進腫瘤細胞脫離原發(fā)灶發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。本實驗主要采用細胞緩慢聚集實驗和分離實驗闡明了VX-680對人肝癌細胞HepG2細胞間黏附能力的影響。細胞緩慢聚集實驗主要是通過用瓊脂包被培養(yǎng)皿的方式模擬細胞在懸浮狀態(tài)下發(fā)生聚集的情況，通過顯微鏡下觀察細胞聚集成細胞團塊的大小、數(shù)量，來判斷細胞間黏附力的強弱。細胞間黏附力強，所形成的細胞團塊數(shù)少，團塊較大且緊密。細胞間黏附力降低時，所形成的細胞團塊相對多，團塊較小且疏松[14]。細胞分離實驗主要是基于E-cadherin對Ca2+的依賴性而設(shè)計的。首先，我們分別用含EDTA(TE)及 CaCl2(TC)的胰酶處理細胞。用含EDTA(TE)的0.2%胰酶處理細胞后，由于EDTA可以螯合金屬陽離子Ca2+而抑制Ca2+依賴型鈣黏蛋白E-cadherin所介導(dǎo)的細胞與細胞間黏附，使細胞間連接破壞，細胞分散為單個細胞。用含CaCl2(TC)的0.2%胰酶處理細胞后，由于Ca2+的存在E-cadherin的黏附功能可以正常發(fā)揮，單層細胞被分散為單個細胞的能力減弱，細胞團塊增多。也就是說，隨著E-cadherin功能的增強，細胞越來越不容易被分散為單個細胞。因此可以用NTC/NTE來反映E-cadherin的功能[15-18]。NTC/NTE值越小，E-cadherin的功能越強，細胞間黏附能力越強。通過細胞緩慢聚集實驗和細胞分離實驗我們發(fā)現(xiàn)，相比對照組，實驗組細胞的細胞聚集能力明顯增強，細胞的分散能力顯著降低；并且隨著VX-680濃度的升高，細胞間的聚集能力逐漸增強。Western blot實驗結(jié)果也證實HepG2細胞中E-cadherin的表達隨著VX-680濃度的升高而增加。另外，劃痕實驗結(jié)果表明，VX-680可以抑制HepG2細胞的遷移。

綜上所述，Aurora蛋白激酶抑制劑VX-680能夠增強人肝癌細胞HepG2細胞間的同質(zhì)黏附力，抑制腫瘤細胞的遷移。

[參 考 文 獻]

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