常景芝， 王 琛， 李宜川， 劉 青， 沈永杰， 蘆 琨， 郭亞莉， 張善鋒， 王明臣△

(1商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 商丘 476100； 2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，河南 鄭州 450001)

流行病學(xué)研究表明葉黃素(lutein)具有較強(qiáng)的抗氧化功能[1-2]，能夠預(yù)防動脈粥樣硬化[3]和老年視黃斑退行性變[4],亦有研究報(bào)道其可抑制腫瘤的生長[5-6]。多種腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)均處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]，這種狀態(tài)可激活NF-κB信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)能夠與抗氧化順式作用元件結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)[8]，進(jìn)而衰減氧化應(yīng)激，阻斷NF-κB信號通路的活化，抑制腫瘤發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)基于以上理論基礎(chǔ)，探討葉黃素對乳腺癌細(xì)胞生長的影響及其可能的分子機(jī)制，了解Nrf2/NF-κB信號通路在這一過程中的作用，為葉黃素預(yù)防和治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

人乳腺癌T47D細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。葉黃素由加拿大農(nóng)業(yè)部食品研究中心惠贈；胎牛血清，胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒均購自Promega；細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)測定試劑盒購自上海杰美基因有限公司；MTT試劑購自Sigma；BCA蛋白定量試劑盒購于Beyotime；鼠抗人GAPDH，Nrf2和p65單克隆抗體及ECL試劑盒均購于北京中杉金橋生物有限公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥品儲存液配制

將人乳腺癌T47D細(xì)胞用含有20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代 1 次。將100 mg葉黃素溶解于1 mL無菌DMSO，渦輪震蕩后，避光保存于-20 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將其稀釋至所需濃度，并用微孔濾器過濾除菌。

3 主要方法

3.1MTT實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的T47D細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，以5×107/L密度接種于96孔板(每孔200 μL)，培養(yǎng)24 h后，加入稀釋好的終濃度為0、6.25、12.5、25和50 mg/L的葉黃素進(jìn)行干預(yù)，分別干預(yù)24 h、48 h和72 h后，棄上清液，每孔加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液(每孔200 μL)及MTT液(每孔20 μL)培養(yǎng)，4 h后，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO振蕩10 min，并于酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率,抑制率(%)=[1-實(shí)驗(yàn)組A570值/對照組A570值]×100%

3.2RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的T47D細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，加入不同濃度的葉黃素進(jìn)行干預(yù)，48 h后，棄去舊培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞后，提取RNA，進(jìn)行濃度的測定。后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPx1)的上游引物序列為5′-CGCGCTTATGACCGACCCCA-3′，下游引物序列為5′-GAGACAGCAGCACTGCAACT-3′；Nrf2的上游引物序列為5′-ACTCGTTGTATTCAGGCGTG-3′，下游引物序列為5′-GTTAAGTAGATATTTTGGCA-3′；超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)的上游引物序列為5′-CGTGTGCGTGCTGAAGGGCG-3′，下游引物序列為5′-GTTTTCTGGATAGAGGATTA-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-TGACAACTTTGGTATCGTGG-3′，下游引物序列為5′-AGGGTCTCTCTCTTCCTCTT-3′。

3.3活性氧簇水平的檢測 用無血清培養(yǎng)基按照1∶1 000比例稀釋熒光指示劑DCFH-DA，調(diào)整終濃度為10 μmol/L。常規(guī)培養(yǎng)T47D細(xì)胞24 h后，用不同濃度的葉黃素干預(yù)細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，懸浮于1 mL稀釋好的DCFH-DA液中，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，每5 min顛倒混勻1次。然后用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)檢測，間接代表細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。

3.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集不同濃度葉黃素干預(yù)48 h后的T47D細(xì)胞，加入含有PMSF的裂解液，于冰上進(jìn)行裂解。4 ℃、12 000 ×g離心后將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中于-20 ℃保存。用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行檢測，加入相應(yīng)體積的上樣緩沖液，100 ℃水浴鍋煮沸5 min，后5 000 r/min離心，取等量適量的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將其放于封閉液中進(jìn)行封閉，并低速搖動。加入相應(yīng)Ⅰ抗，4 ℃過夜，TBST洗膜后，室溫下孵育Ⅱ抗2 h，后TBST洗膜，加入配制的DAB顯色工作液，曝光、檢測條帶相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示。多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法觀察葉黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示隨著葉黃素濃度增加和作用時(shí)間的延長，葉黃素對T47D細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，呈劑量時(shí)間依賴性(P<0.01),見圖1。

Figure 1. The effects of lutein on T47D cells viability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L group;△P<0.05vs24 h group;#P<0.05vs48 h group.

圖1葉黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞活力的影響

2 RT-qPCR法檢測葉黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞Nrf2、GPx1及SOD2 mRNA表達(dá)的影響

不同濃度葉黃素作用于T47D細(xì)胞48 h后，與對照組相比，隨著葉黃素濃度增加，Nrf2、GPx1及SOD2的mRNA水平均增加(P<0.05),見圖2。

Figure 2. The effects of lutein on the mRNA expression of Nrf2, GPx1 and SOD2 in the breast cancer T47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖2葉黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞Nrf2，GPx1和SOD2mRNA水平的影響

3 葉黃素對細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

不同濃度葉黃素處理T47D細(xì)胞48 h后，與對照組相比，各劑量葉黃素組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平均顯著降低(P<0.05),見圖3。

4 葉黃素對Nrf2-NF-κB通路Nrf2和p65蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，不同濃度的葉黃素呈濃度依賴性促進(jìn)了Nrf2蛋白的表達(dá)(P<0.05)；與此同時(shí)，p65蛋白的表達(dá)隨著葉黃素濃度的增加逐漸降低，且同樣呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05),見圖4。

Figure 3. The effects of lutein on ROS level in the breast cancer T47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3葉黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞ROS水平的影響

Figure 4. The effects of lutein on the protein expression of Nrf2 and p65 in the breast cancer T47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖4葉黃素對乳腺癌T47D細(xì)胞Nrf2和p65蛋白表達(dá)的影響

討 論

醫(yī)學(xué)研究證明，天然葉黃素是一種性能優(yōu)異的抗氧化劑[9]，能抑制活性氧自由基的活性，阻止其對細(xì)胞的破壞。機(jī)體常攝入適量的葉黃素可預(yù)防心血管疾病的發(fā)生、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤的生長。研究表明，葉黃素能夠抑制多種腫瘤的生長，如胃癌和結(jié)腸癌等[10-11]。然而，關(guān)于葉黃素抑制乳腺癌細(xì)胞生長及相關(guān)的分子機(jī)制研究卻很少。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)葉黃素干預(yù)的乳腺癌T47D細(xì)胞生長受到明顯抑制，且這種抑制作用與葉黃素濃度和作用時(shí)間正相關(guān)，表明葉黃素抑制乳癌癌細(xì)胞的生長呈現(xiàn)劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

多數(shù)腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，通過與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。我們的研究結(jié)果顯示，不同劑量的葉黃素干預(yù)T47D細(xì)胞后，與對照組相比，隨著葉黃素濃度增加，Nrf2，GPx1及SOD2的mRNA水平均增加，Nrf2蛋白表達(dá)增加，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，提示葉黃素抑制乳腺癌細(xì)胞生長可能通過上調(diào)Nrf2，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶GPx1及SOD2的mRNA水平增高，增加細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。不僅如此，與對照組相比，各劑量葉黃素均可降低細(xì)胞ROS的水平，提示葉黃素抑制乳腺癌細(xì)胞生長在增加抗氧化酶表達(dá)的同時(shí)，也降低了細(xì)胞內(nèi)ROS含量，減輕了細(xì)胞氧化損傷。

多種腫瘤細(xì)胞中NF-κB都呈持續(xù)性激活狀態(tài)，可被炎癥因子、促癌劑、致癌劑和腫瘤微環(huán)境等因素激活。ROS過多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可作為第二信使參與調(diào)控NF-κB通路。抑制NF-κB途徑可以阻斷腫瘤細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。哺乳動物細(xì)胞中，NF-κB家族成員較常見的是p65與p50結(jié)合形成的p65/p50二聚體。我們的研究表明，NF-κB通路中p65蛋白質(zhì)水平以葉黃素劑量依賴性方式顯著降低，說明葉黃素使NF-κB通路失活，這可能是通過誘導(dǎo)抗氧化劑表達(dá)及降低氧化應(yīng)激水平來部分介導(dǎo)的。

綜上所述，我們推測葉黃素能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，這可能與通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)，誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)和降低氧化應(yīng)激水平，阻斷NF-κB信號通路有關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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