王迪龍， 邱寶山， 林 晶， 蔡 穎， 范玉華

(中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 廣東 廣州 510030)

腦白質(zhì)病變(white matter lesions，WMLs)是指血管源性的腦白質(zhì)異常，影像學表現(xiàn)為T2加權成像中的白質(zhì)區(qū)域高信號，主要癥狀包括認知功能下降、步態(tài)異常和排尿障礙顯著[1]。隨著影像學技術的發(fā)展，目前WMLs在高齡人群中發(fā)現(xiàn)率可達90%以上[2]。目前多項證據(jù)提示缺血是導致WMLs的重要病因，但由于病理機制復雜，缺血與WMLs的具體關系仍不清楚。內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)是人體內(nèi)最強效的縮血管物質(zhì)[3]，通過結(jié)合血管平滑肌細胞上的內(nèi)皮素受體A(endothelin receptor A，ETRA)發(fā)揮縮血管作用。近年來動物實驗證實ET-1與延遲性腦組織損傷有關[4-6]，而ETRA選擇性和非選擇性ETRA拮抗劑則具有神經(jīng)保護作用，其中安倍生坦作為一種選擇性ETRA拮抗劑，長期應用可減輕血管源性認知功能損害[7]。本實驗的目的是觀察選擇性ETRA拮抗劑的應用是否能夠改善腦白質(zhì)病變的嚴重程度，并探索其機制。我們采用的易卒中型腎血管性高血壓改良的2VO(stroke-prone renovascular hypertensive rats-modified 2 vessel occlusion，RHRSP-modified 2VO)大鼠模型[8]能夠模擬人WMLs中慢性高血壓繼發(fā)性腦缺血的病理過程，并被證實存在認知功能障礙和相關病理改變，是適用于研究WMLs的動物模型。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組

33只4周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重80～90 g,購于廣東省實驗動物中心，動物合格證編號為SCXK(粵)2013-0034，飼養(yǎng)于中山大學北校區(qū)實驗動物中心(SPF級環(huán)境)。隨機分為假手術(sham)組(n=9)，治療(treatment)組[RHRSP-modified 2VO+安倍生坦(n=12)]和溶劑對照(placebo)組[RHRSP-modified 2VO+0.5%羧甲基纖維素鈉(n=12)]，實驗過程全部遵循科技部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

2 方法

2.1大鼠RHRSP-modified 2VO模型的制作 治療組和溶劑對照組的幼年大鼠按照雙腎雙夾法[9]制作RHRSP-modified 2VO模型。12周后取造模成功的大鼠(收縮壓>180 mmHg)先進行右側(cè)頸總動脈夾閉(5-0縫合絲線先后結(jié)扎遠、近心端后剪斷頸總動脈)，24 h后用同樣方式夾閉左側(cè)頸總動脈；假手術組除了鉗夾和結(jié)扎腎/頸總動脈外，其余操作一樣。

2.2給藥方法 安倍生坦溶于0.5%羧甲基纖維素鈉，制備藥物濃度為5 g/L；17周(雙腎雙夾術后，下同)開始對治療組灌胃給藥(5 mg·kg-1·d-1)，溶劑對照組和假手術組給予相同劑量的0.5 %羧甲基纖維素鈉(5 mL·kg-1·d-1)灌胃，持續(xù)至20周。

2.3血壓測量 用ML866 Powerlab 4/30 型大鼠血壓計(ADInstruments Pty Ltd)經(jīng)尾動脈測定各組大鼠收縮壓；12周評估RHRSP-modified 2 VO造模情況，收縮壓超過180 mmHg定義為造模成功；給藥期間(17～20周)連續(xù)監(jiān)測血壓變化，每周測量1次。

2.4Morris水迷宮實驗 20周對大鼠進行Morris水迷宮實驗，實驗流程參照既往研究中的步驟進行[7]。大鼠于實驗前 1 天在池中自行游泳 180 s 以適應水溫和環(huán)境，第 1～5 天為定位航行實驗(第III象限中間放置平臺，大鼠按4個入水點順序放入水池，每只大鼠入水順序相同，入水開始至登入平臺為逃避潛伏期，如果 60 s 未找到平臺則引導其登入平臺，此時記錄為 60 s)，以每天4個入水點的逃避潛伏期均數(shù)記錄為每天的逃避潛伏期；第 6 天為空間探索實驗，撤掉平臺，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)及停留于第III象限的時間。

2.5腦組織取材 水迷宮實驗結(jié)束后，用灌注取腦術處死所有大鼠；4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后取出大腦，4%多聚甲醛浸泡24 h以固定蛋白，隨后用20%～30%蔗糖溶液梯度浸泡脫水，于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，包埋后制成冠狀面連續(xù)冰凍切片(10 μm)；生理鹽水灌注后取出大腦，于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，-80 ℃保存。

2.6Luxol fast blue(LFB)染色 每只大鼠取同一層面切片進行LFB染色：冰凍切片水化后放入0.1%LFB 染液于60℃烘箱過夜，先后浸泡 0.05%碳酸鋰和70%乙醇分化，梯度脫水、透明處理后封片，顯微鏡下觀結(jié)果。參照Zeng等[9]分級方法進行WMLs分級：0級:正常；1級:神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂；2級:明顯空泡形成；3級:有髓神經(jīng)纖維消失。

2.7免疫熒光雙標記 為了觀察皮層、胼胝體和尾殼核中ET-1與α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscles actin，α-SMA)的共定位，將冰凍切片水化后進行免疫熒光染色，封閉液封閉90 min后在4 ℃環(huán)境下孵育 I 抗16 h[小鼠抗大鼠α-SMA(1∶200，Abcam)、兔抗大鼠ET-1(1∶400，Abcam)]，隨后孵育熒光 II 抗1 h[抗兔紅光(1∶500，Cell Signing)、抗小鼠綠光(1∶500, Cell Signing)]，最后用DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

2.8ELISA法測定ET-1蛋白含量 從上述準備好的腦組織中分別取皮層、胼胝體和尾殼核組織用于ET-1蛋白含量分析，參照ELISA試劑盒(R&D systems)的說明書進行操作。

3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。水迷宮實驗逃避潛伏期結(jié)果使用重復測量設計方差分析，WMLs分級使用Mann-Whitney U檢驗，其余數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性情況下組間比較使用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 血壓測量結(jié)果

術后16周(基線)治療組和溶劑對照組的收縮壓明顯高于假手術組(P<0.05)；給藥期間，17～19周治療組與溶劑對照組間收縮壓差異無統(tǒng)計學意義，而在20周治療組收縮壓低于溶劑對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The systolic arterial pressure in different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsplacebo group.

圖1各組大鼠動脈收縮壓測量結(jié)果

2 Morris水迷宮實驗結(jié)果

在定位航行實驗中，3組大鼠的逃避潛伏期均呈縮短趨勢；與溶劑對照組相比，治療組逃避潛伏期明顯縮短，在第3天和第5天具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而與假手術組相比，溶劑對照組逃避潛伏期延長(P<0.05)，見圖2A；在第6天的空間探索實驗中，與溶劑對照組相比，治療組穿越平臺次數(shù)增多(P<0.05)，而與假手術組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2B；與溶劑對照組相比，治療組在第III象限停留時間所占比例有增加趨勢，但兩者差異無統(tǒng)計學顯著性；與假手術組相比，溶劑對照組在第III象限停留時間所占比例減少(P<0.05)，見圖2C。

Figure 2. The results for water Morris water maze test. A: the changes of escape latency； B: the numbers of crossing platform； C: the ratio of time spend in the target quadrant. Mean±SD.n=6*P<0.05vssham group;#P<0.05vsplacebo group.

圖2Morris水迷宮實驗結(jié)果

3 LFB染色結(jié)果

與假手術組和治療組相比，溶劑對照組大鼠腦白質(zhì)神經(jīng)纖維出現(xiàn)疏松、彌散性空泡形成及有髓神經(jīng)纖維的消失，見圖3；WMLs分級結(jié)果顯示，治療組分級顯著低于溶劑對照組(1.75±0.58vs2.25±0.50，P<0.05)，顯著高于假手術組(1.75±0.58vs0.25±0.50，P<0.05)。

Figure 3. The images of corpus callosum beside lateral ventricle under light microscope with LFB staining (×400). A: sham group; B: treatment group; C: placebo group. * indicated lateral ventricle.

圖3LFB染色觀察側(cè)腦室旁胼胝體

4 免疫熒光雙標結(jié)果

免疫熒光雙標結(jié)果顯示，假手術組(圖4 A、B、C)和治療組(圖4G、H、I)均未發(fā)現(xiàn)明顯ET-1與α-SMA共定位，而溶劑對照組在皮層(圖4 D)、胼胝體(圖4 E)和尾殼核(圖4 F)均發(fā)現(xiàn)有以小血管區(qū)域為主的共定位。

Figure 4. Double-labeled immunofluorescence of ET-1 (red) and α-SMA (green) to observe co-localization in cortex, corpus callosum and caudate putamen. Co-localization were not observed in the sham group (A, B, C, ×200) and the treatment group (G, H, I, ×400), but evidently observed in the placebo group (marked by white triangles, ×200) in areas of cortex (D), corpus callosum (E) and caudate putamen (F).

圖4免疫熒光雙標觀察3組大鼠皮層、胼胝體和尾殼核區(qū)域ET-1和α-SMA的共定位情況

5 ELISA結(jié)果

各組大鼠皮層內(nèi)ET-1蛋白含量差異無統(tǒng)計學顯著性；在胼胝體和尾殼核內(nèi)，與溶劑對照組相比，治療組的ET-1蛋白含量明顯降低(P<0.05)，與假手術組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

Figure 5. The protein levels of ET-1 in the cortex, corpus callosum and caudate putamen were measured by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05vstreatment group.

圖5ELISA法測定各組大鼠皮層、胼胝體和尾殼核內(nèi)ET-1蛋白含量

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)選擇性ETRA拮抗劑安倍生坦能夠減輕高血壓慢性缺血狀態(tài)下的腦白質(zhì)損傷并改善腦白質(zhì)病變大鼠的認知功能，而這種增益效果與降低血壓無明顯關系。目前國內(nèi)外少有關于以ET-1和ETRA作為腦白質(zhì)病變治療靶點的研究，我們的實驗結(jié)果與之前關于內(nèi)皮素系統(tǒng)和腦缺血的實驗結(jié)果一致[4-6]，均發(fā)現(xiàn)在缺血狀態(tài)下存在顱內(nèi)內(nèi)皮素系統(tǒng)的活躍，而ETRA選擇性阻滯劑的應用可以降低ET-1水平并減輕腦損傷。而與其它短期缺血性實驗不同的是，我們的將皮層、胼胝體和尾殼核分別進行觀察，更進一步研究了在慢性腦缺血環(huán)境下ET-1的表達及分布特點，對內(nèi)皮素受體拮抗劑減輕腦白質(zhì)病變大鼠慢性缺血狀態(tài)下的腦白質(zhì)損傷的機制進行了初步研究。

1 內(nèi)皮素-1與腦白質(zhì)病變

以往研究證實ET-1水平的升高與缺血相關，在局灶性梗死模型中， ET-1的高表達區(qū)域主要集中在缺血半暗帶，升高的ET-1水平與梗死面積呈正相關[10]，而在全腦缺血模型中， ET-1則表現(xiàn)為全腦彌散性高表達[11]。與之前研究一致，本實驗中RHRSP-modified 2VO大鼠模型與正常大鼠相比皮層、胼胝體和尾殼核區(qū)域的ET-1蛋白水平升高。Lehmberg等[4]發(fā)現(xiàn)ET-1升高與全腦缺血后顱內(nèi)微循環(huán)障礙相關；Murray等[12]的研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后ET-1與神經(jīng)炎癥反應共同影響了缺血后組織再灌注機制。而腦白質(zhì)由于其解剖位置處于供血分水嶺區(qū)域，對缺血更敏感。本實驗發(fā)現(xiàn)ET-1與α-SMA共定位最明顯的區(qū)域在小血管周圍，尤其是側(cè)腦室周圍的白質(zhì)，而側(cè)腦室周圍白質(zhì)在以往的研究中被證實是大鼠最常出現(xiàn)腦白質(zhì)病變的區(qū)域[13]。這一結(jié)果提示在慢性缺血的情況下小血管對ET-1敏感性可能增高。同樣，部分研究認為是血流動力學改變而非血管狹窄或梗阻引起了白質(zhì)缺血，并進一步導致白質(zhì)損傷[14]。綜上所述，我們認為ET-1水平升高并與小血管結(jié)合引起的微循環(huán)障礙可能是腦白質(zhì)病變的病因之一。

2 選擇性內(nèi)皮素受體A拮抗劑與腦白質(zhì)病變

Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)安倍生坦治療組較溶劑對照組逃避潛伏期短，穿越平臺次數(shù)多，提示腦白質(zhì)病變的認知功能得到改善。而進一步的組織病理學研究發(fā)現(xiàn)治療組的白質(zhì)病變嚴重程度以及小血管周圍ET-1的表達量較溶劑對照組低。然而與溶劑對照組相比，治療組的收縮壓下降程度不大，這提示安倍生坦的增益效果可能與降低血壓無明顯關系，這一點與Kalk等[15]的實驗結(jié)果類似。雖然在部分研究中選擇性ETRA拮抗劑可顯著降低血壓[16]，但這可能與他們使用的高鹽飲食模型有關。生理狀態(tài)下的ET-1主要由內(nèi)皮細胞分泌，通過旁分泌的形式作用于平滑肌細胞，同時血管周圍星形膠質(zhì)細胞參與其合成調(diào)節(jié)。但在病理狀態(tài)下激活的小膠質(zhì)細胞也可參與調(diào)節(jié)ET-1的合成與分泌[3]，這可能是其水平上升的原因之一。損傷區(qū)域升高的ET-1作用于血管平滑肌加重血流動力學障礙產(chǎn)生延遲性損傷，進而導致惡性循環(huán)。而安倍生坦拮抗ETRA后可阻止延遲性損傷，終止惡性循環(huán)，與本實驗中拮抗ETRA后，白質(zhì)和認知功能損害減輕及ET-1水平下降的現(xiàn)象一致。然而，選擇性ERTA拮抗劑改善腦白質(zhì)病變的具體機制尚不清楚，仍有待進一步研究。多數(shù)關于急性和亞急性缺血/梗死的研究證明，短期應用ETRA選擇性拮抗劑可以改善腦組織供血[4]、抑制神經(jīng)炎癥反應[12]、減輕氧化應激反應[6]，起到神經(jīng)保護作用。與本研究結(jié)果類似，Mangat等[7]在動脈粥樣硬化大鼠模型中長期應用安倍生坦發(fā)現(xiàn)可改善血管性癡呆。上述證據(jù)與我們的研究結(jié)果共同提示，選擇性ETRA拮抗劑與降壓藥物聯(lián)合可能可以作為腦白質(zhì)病變的新型治療策略。

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)在RHRSP-modified 2VO模型中應用選擇性ETRA拮抗劑安倍生坦能夠減輕腦白質(zhì)病變大鼠慢性缺血狀態(tài)下的腦白質(zhì)損傷，并改善認知功能損害，且這種增益效果可能與直接拮抗白質(zhì)區(qū)域小血管平滑肌上的ETRA有關，而與降低血壓無明顯關系。提示ET-1水平升高并與小血管結(jié)合引起的微循環(huán)障礙可能是腦白質(zhì)病變的病因之一，ET-1與ETRA可能可以作為腦白質(zhì)病變的新型治療靶點。

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