陳華劍， 張欽紅， 張 薇

(重慶市急救醫(yī)療中心檢驗科， 重慶 400014)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤。2012年新診斷的患者約有782 000例，其中約有50%發(fā)生在中國，肝細胞癌的預后極差，在全球各種惡性腫瘤中死亡率位居第二，2012年約有746 000例患者死亡[1]。起病隱匿、放化療效果差是導致肝細胞癌預后不良的主要原因[2]，因此，研究HCC發(fā)生發(fā)展以及惡性增殖的分子機制具有十分重要的意義。鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，最初被發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的卵母細胞中[3]?，F(xiàn)已知ZFP分布廣泛，人類基因組中有約1%的序列編碼有鋅指結構的蛋白質[4]。鋅指蛋白281(ZNF281)也可稱之為ZBP-99，其基因位于1號染色體，參與調控胚胎干細胞的分化與組織的發(fā)育[5]。近年來，ZNF281還被鑒定為與致癌基因c-MYC相關[6]。在結腸癌與胰腺癌中，ZNF281也發(fā)揮著重要的作用[7-9]。目前對于ZNF281在肝細胞癌中的作用尚無報道?；谏鲜鲈?，我們將對ZNF281在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用展開研究。在本研究中，我們首先檢測了在80例健康人群及206例肝癌患者外周血單個核細胞中ZNF281的 mRNA表達水平，并將其與多個臨床病理參數(shù)進行相關性分析；接下來，我們檢測了ZNF281在肝癌細胞和永生化肝細胞中的mRNA及蛋白表達水平，并在肝癌細胞中利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默ZNF281的表達，觀察其對肝癌細胞增殖的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

隨機收集重慶市急救醫(yī)療中心檢驗科2015年1月～2016年12月間206例肝癌患者的外周血。80例健康人群對照組外周血來自隨機抽取的健康體檢中心門診。人外周血淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；肝癌細胞系Huh-7購于日本人類科學研究資源庫(Humon Science Research Resources Bank，HSRRB)；肝癌細胞系PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721及永生化肝細胞系MIHA購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)；非靶向對照siRNA(siCont)及靶向沉默ZNF281的siRNA(siZNF281)由銳博公司合成；轉染試劑HiPerFect Transfection Reagent購于QIAGEN；RNA提取TRIzol試劑購于Invitrogen；逆轉錄試劑盒購于Bio-Rad；FastStart Essential DNA Green Master Mix購于Roche；抗ZNF281抗體購于Sigma；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG及NC膜購于GE；抗β-actin抗體購于Cell Signaling Technology；BCA試劑盒購于Thermo；CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑購于Promega；Cell-LightTMEdU Apollo?488InVitroImaging Kit試劑盒購于銳博公司。

2 方法

2.1單個核細胞的分離提取 向羅口試管中加入淋巴細胞分離液，再加入等體積血液樣本于分離液的液面上，水平離心機離心，500×g離心30 min后，羅口試管中液體分為4層，從上到下依次為血漿層、環(huán)狀乳白色淋巴細胞層、透明分離液層和紅細胞層。小心吸取第2層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一羅口試管中，并用生理鹽水洗滌。

2.2細胞培養(yǎng) 肝癌細胞系Huh-7、PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721及永生化肝細胞系MIHA均于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1% 青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于含有5% CO2、37 ℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3siRNA轉染 接種SK-Hep-1細胞6×104和Huh-7細胞1.2×105至6孔板中，24 h后更換為無抗生素的DMEM+10% FBS。并將siRNA(終濃度為10 nmol/L)與轉染試劑12 μL加入100 μL Opti-MEM中充分混勻，靜置10 min后逐滴滴入6孔板中。轉染效率檢測使用之前已明確有效的siRNA進行轉染并檢測沉默效率，若抑制率高則可說明轉染效率高且檢測方法正常。

2.4RNA的提取及real-time PCR 將單個核細胞，肝癌細胞Huh-7、PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721，永生化肝細胞MIHA以及轉染siRNA后的細胞以1 mL TRIzol裂解，用200 μL氯仿萃取RNA，并用異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌。干燥，去RNase水溶解后取1 μg逆轉錄為cDNA。接著進行real-time PCR檢測，以β-actin為內參照，設置3個復孔。PCR反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s,34個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。β-actin的上游引物序列為5’-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，下游引物序列為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’； ZNF281的上游引物序列為5’-AGCACCACCGTGACGTATTA-3’，下游引物序列為5’-AGATGCACTTGGCTTCCTCT-3’。

2.5Western blot實驗 將肝癌細胞Huh-7、PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721，永生化肝細胞MIHA以及轉染siRNA后的細胞用適量含PI的RIPA裂解液裂解，4 ℃搖床裂解20 min，16 000×g離心5 min，移液器挑出黏液沉淀物質?？偟鞍诐舛扔葿CA試劑盒檢測，SDS-PAGE每孔上樣30 μg總蛋白，待蛋白分離后將其轉至NC膜，5% 脫脂牛奶封閉1 h。4 ℃搖床孵育 I 抗過夜，室溫孵育 II 抗2 h。以β-actin為內參照。

2.6MTS實驗檢測細胞活力 轉染SK-Hep-1細胞和Huh-7細胞24 h后將siCont組與siZNF281組細胞消化計數(shù)，并分別接種6 000個細胞至96孔板中。于轉染2 d、3 d、4 d和5 d后分別向96孔板中加入20 μL MTS試劑，并置于37 ℃ 孵育1 h后490 nm檢測吸光度。檢測儀器為購于BioTek的Synergy H1 Microplate Reader。

2.7EdU標記實驗 接種SK-Hep-1細胞和Huh-7細胞前分別將蓋玻片置于6孔板中，轉染3 d后用多聚甲醛固定并進行EdU實驗，具體按照試劑盒說明書進行操作。

2.8平板集落形成實驗 轉染SK-Hep-1細胞和Huh-7細胞24 h后分別將siCont組與siZNF281組細胞消化計數(shù)，并分別接種2 000個細胞至6孔板中，每3 d換液一次。待肉眼觀察到明顯集落時用冰甲醇固定10 min，0.1%結晶紫染色。

2.9軟瓊脂集落形成實驗 將含有20% FBS的2×DMEM與濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠充分混勻后作為下層膠。轉染SK-Hep-1細胞和Huh-7細胞24 h后將siCont組與siZNF281組細胞消化至含有20% FBS的2×DMEM中進行計數(shù)，制備每孔2 000個細胞的細胞懸液，并與0.7%瓊脂糖凝膠混勻作為上層膠。每3 d向6孔板中滴入幾滴完全培養(yǎng)基以保證營養(yǎng)物質的供給。3周后，待肉眼可觀察到明顯集落后用0.05% 結晶紫染色。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗;兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗;多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，其兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 ZNF281在健康人群及肝癌患者外周血單個核細胞中的表達差異

提取健康人及肝癌患者外周血單個核細胞中的RNA后進行real-time PCR檢測。結果顯示，在健康人樣本中，ZNF281 mRNA相對表達水平為1.040±0.069，在肝癌患者樣本中，ZNF281 mRNA相對表達水平為8.451±0.846，在肝癌患者中，ZNF281的mRNA表達水平顯著高于健康人群(P<0.01),見圖1。我們將肝癌患者單個核細胞中ZNF281 mRNA表達水平與臨床病理參數(shù)的相關性進行統(tǒng)計學分析，結果顯示ZNF281的mRNA表達水平與腫瘤的大小(P=0.002 9)、分期(P=0.004 3)及血管侵襲性呈正相關(P=0.001 3),但與患者的性別、年齡，腫瘤的個數(shù)、分級、壞死，以及肝硬化無相關性，見表1。

2 ZNF281在肝癌細胞和永生化肝細胞中的表達差異

基于上述ZNF281在臨床樣本中的表達情況，我們進一步利用real-time PCR和Western blot實驗檢測ZNF281在肝癌細胞和永生化肝細胞中的mRNA和蛋白表達水平，結果顯示ZNF281在肝癌細胞系中的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于永生化肝細胞(P<0.01),見圖2。

Figure 1. The mRNA expression levels of ZNF281 in the peri-pheral blood mononuclear cells.**P<0.01vsheal-thy people.

圖1外周血單個核細胞中ZNF281的mRNA表達水平

表1ZNF281的mRNA表達水平與肝細胞癌臨床病理參數(shù)的相關性

Table 1. Correlations between ZNF281 mRNA expression and clinicopathologic parameters

ClinicopathologicparameternZNF281expressionLowHighPSex2060.6855 Female351124 Male17148123Age(year)2060.2534 ≤50761660 >501303793Tumorsize(cm)2060.0029 ≤3542232 >315229123Tumornumber2060.5958 =114739108 >1591346Tumorgrade2060.9604 121912 21506189 3351520Tumorstage2060.0043 1421626 2891970 375966Vascularinvasion2060.0013 No14141100 Yes65659Tumornecrosis2060.5266 No882167 Yes1183385Cirrhosis2060.8744 No642143 Yes1424993

Figure 2. The mRNA and protein expression level of ZNF281 in hepatoma cell lines and immortalized hepatocytes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMIHA group.

圖2肝癌細胞及永生化肝細胞中ZNF281的表達水平

3 ZNF281可促進肝癌細胞的活力

用Western blot實驗檢測siRNA沉默ZNF281的效率，結果顯示Huh-7和SK-Hep-1中的沉默效率分別約為80%和50%，見圖3A。并在此基礎上進行MTS實驗，結果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細胞的存活率(P<0.01)，見圖3B。

Figure 3. The effect ofZNF281 silencing on the viability of HCC cells. A: the silencing ofZNF281 determined by Western blot analysis; B: the viability of HCC cells determined by MTS assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖3MTS實驗檢測沉默ZNF281對肝癌細胞活力的影響

4 ZNF281可促進肝癌細胞的DNA合成能力

DNA合成能力增強是細胞惡性增殖的重要表現(xiàn)之一，EdU標記實驗結果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細胞的DNA合成能力，抑制率達55%(P=0.000 8)及44%(P=0.002 5)，見圖4。這一結果進一步說明了沉默ZNF281確實可以抑制肝癌細胞的增殖能力。

Figure 4. The effect ofZNF281 silencing on the DNA synthesis of the HCC cells detected by EdU incorporation assay (×400). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖4EdU標記實驗檢測沉默ZNF281對肝癌細胞DNA合成能力的影響

5 ZNF281可促進肝癌細胞的集落形成能力及錨定非依賴生長能力

平板集落實驗結果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細胞的集落形成能力，抑制率達65%(P=0.000 2)及53%(P=0.000 5),見圖5。軟瓊脂集落形成實驗反映細胞的錨定非依賴生長能力，結果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細胞的錨定非依賴性生長能力，抑制率達59%(P=0.000 2)及47%(P=0.001 5)，見圖6。

討 論

鋅指蛋白ZNF281與ZBP-89被報道具有極大的相似性，ZBP-89參與調控了細胞的增殖、凋亡、分化以及腫瘤的形成[10-13]。目前對ZNF281的研究顯示，在胚胎干細胞的自我更新、分化以及靜止期中，ZNF281都發(fā)揮了不同的重要作用[14-15]。近年來，ZNF281在腫瘤中的作用引起了研究者們的重視，在結腸癌中，ZNF281可促進上皮-間充質轉化(epithe-lial-mesenchymal transition, EMT)，增加結腸癌細胞的轉移侵襲能力;在胰腺癌中，ZNF281可激活Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進細胞的增殖和轉移。在本研究中，我們檢測了80例健康人及206例肝癌患者外周血單個核細胞中ZNF281的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)ZNF281在肝癌病人的單個核細胞中的表達水平遠遠高于健康人群。Real-time PCR與Western blot檢測ZNF281在肝癌細胞系和永生化肝細胞中的表達，結果也顯示ZNF281在肝癌細胞系中的表達顯著高于永生化肝細胞。以上結果說明ZNF281在肝癌細胞中呈現(xiàn)異常高表達，提示其有可能作為一種腫瘤促進因子發(fā)揮作用。ZNF281與Snail和miR-34之間存在的共同調節(jié)為我們解析為何ZNF281在肝癌細胞中表達升高奠定了基礎。將206例肝癌病人外周血單個核細胞中ZNF281的mRNA表達水平與多個臨床病理參數(shù)進行相關性分析，結果顯示，表達量異常升高的ZNF281與腫瘤的大小、腫瘤的分期以及腫瘤的血管侵襲性相關，這為我們進一步檢測沉默ZNF281對肝癌細胞轉移侵襲能力的影響提供了依據(jù)。在Huh-7和SK-Hep-1細胞中沉默ZNF281的表達可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，DNA合成能力，集落形成能力以及錨定非依賴性生長能力。平板集落實驗的改變主要表示了細胞獨立生存能力的改變，它僅對于集落形成提供信息；所以接下來，我們進行了軟瓊脂集落形成實驗，它除了對細胞的集落形成提供信息，也顯示了細胞的錨定非依賴性生長能力和主動移動能力與其惡性程度和侵襲能力相關。這就從功能上驗證了ZNF281確實可以促進肝癌細胞的增殖。影響腫瘤細胞增殖的原因復雜，凋亡減少，周期改變等等均可導致細胞增殖加速。有文獻證實缺失ZNF281可以誘導G0/G1期阻滯，從而抑制細胞的增殖,且Wnt/β-catenin信號通路的激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著十分重要的作用[9]。這為我們下游的機制研究提供了重要依據(jù)。

Figure 5. The effect ofZNF281 silencing on the ability of colony formation in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖5平板集落形成實驗檢測沉默ZNF281對肝癌細胞集落形成能力的影響

Figure 6. The effect ofZNF281 silencing on the ability of anchorage-independent growth in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖6軟瓊脂集落形成實驗檢測沉默ZNF281對肝癌細胞錨定非依賴性生長能力的影響

綜上所述，本研究證實了ZNF281在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中具有促進腫瘤增殖的作用，為下一步開展研究奠定了極好的基礎，也為更深入解析肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的復雜機制做出了貢獻，并且對肝細胞癌個性化治療提供了有利依據(jù)。

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