趙 雙，周 芳，楊 雋

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 細胞生物系 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一種肺小動脈原發(fā)性病變，是當肺動脈壓力超過一定界值(25 mmHg, 海平面靜息狀態(tài)) 的血流動力和病理生理狀態(tài)。PAH的主要特征是肺血管過度收縮、異常血管重構(gòu)和肺小動脈阻塞[1]。血管重構(gòu)主要由內(nèi)皮細胞(endothelial cells, ECs)功能紊亂和α-SMA陽性細胞大量增多引起[2]。內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)導致肺血管中α-SMA陽性細胞積累，參與了血管重構(gòu)的發(fā)生[3]。

到目前為止骨成形蛋白Ⅱ型受體(BMPRⅡ)突變是PAH患者中最常見的突變類型。重編程技術(shù)的出現(xiàn)得以使相關(guān)研究不再局限在疾病終末期細胞類型，通過將患者來源的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)定向分化為ECs，為研究PAH血管重構(gòu)提供發(fā)育模型[4- 5]。本研究選取正常人和遺傳性PAH(heritable PAH, HPAH)患者來源的肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells，hPASMCs)，重編程為iPSCs，再將其定向分化為ECs，建立HPAH體外疾病模型。比較對照(CON)和HPAH來源iPSC-ECs的轉(zhuǎn)分化相關(guān)基因表達和成管功能差異，旨在探討HPAH血管重構(gòu)的可能發(fā)生機制，為針對肺血管重構(gòu)進行靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：Essential8TM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、無酚紅IMDM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和免疫熒光二抗(Thermo Fisher公司)；基質(zhì)膠(BD公司)；VEGF165、Trizol總RNA提取試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；小鼠抗人CD31抗體和小鼠抗人α-SMA抗體(Dako公司)；兔抗人VE-cadherin抗體(CST公司)；兔抗人CD146抗體(Abcam公司)；CD31免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)；仙臺病毒重編程試劑盒(Invitrogen公司)。

1.1.2 標本來源：PAH患者和CON志愿者hPASMCs由英國劍橋大學Nicholas W Morrell實驗室饋贈，PAH 患者通過基因測序鑒定了BMPRII C347R突變，CON hPASMCs取自肺癌患者肺移植遠離腫瘤部位的肺組織。

1.2 方法

1.2.1 誘導產(chǎn)生和培養(yǎng)多能干細胞：將仙臺病毒轉(zhuǎn)染導入hPASMCs后接種于6孔板，按說明書兩周左右形成iPSCs克隆，對其進行標準鑒定。iPSCs培養(yǎng)于Essential 8TM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，5 d傳代。

1.2.2 內(nèi)皮細胞的分化：配制中胚層分化養(yǎng)基和血管分化培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)至匯合度為80%，按1∶40比例傳代，每天換液，培養(yǎng)3 d后，即分化第0天，將Essential 8TM培養(yǎng)基換成中胚層分化培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d；分化第3天，將中胚層分化培養(yǎng)基換成血管分化培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2 d；分化第5天，更換新鮮血管分化培養(yǎng)基。

1.2.3 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)：分化第7天，用CD31免疫磁珠富集內(nèi)皮細胞，接種于明膠包被的培養(yǎng)皿中，Endothelial cell-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，4 d傳代1次，細胞可傳代培養(yǎng)5代。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測mRNA：收集分化第0、1.5、3、5和7天樣品，Trizol法提取總RNA，檢測其濃度，將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH基因為內(nèi)參基因，擴增NANOG、OCT4、Brachyury、KDR、CD31和α-SMA等基因，查詢文獻，設計合成引物(表1)。

1.2.5 間接免疫熒光染色檢測內(nèi)皮表面標志分子：細胞培養(yǎng)在細胞爬片上，增殖至合適匯合度，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍。每孔加入100 μL 4%的多聚甲醛固定，4 ℃放置30 min。棄去固定液， 每孔加300 μL PBS，室溫放置5 min， 棄洗滌液，重復3次。棄去清洗液后，加入300 μL含0.3% Triton X-100的PBS，室溫放置3 min。用PBS清洗3遍，每次5 min，用含5%驢血清的PBS室溫封閉1 h。封閉后加入一抗，4 ℃過夜。棄去一抗，PBS清洗3遍，每次5 min，再加入二抗室溫避光孵育1 h。棄去二抗，用PBS清洗3遍，每次5 min，最后加入DAPI，室溫避光放置5 min，PBS清洗3遍后熒光顯微鏡下觀察拍照。

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequences of primers for qPCR

1.2.6 成管實驗：預先用基質(zhì)膠包被96孔板，放入37 ℃培養(yǎng)箱，15 min后消化細胞，細胞計數(shù)，96孔板每孔接種10 000個細胞，分為對照組和VEGF165處理組，對照組加入無血清培養(yǎng)基，VEGF165處理組加入含有30 μg/L VEGF165的無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 h后顯微鏡下觀察拍照，用Image J軟件分析統(tǒng)計成管數(shù)目、結(jié)點數(shù)目及成管長度。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 iPSCs向ECs分化的細胞形態(tài)變化

分化1 d細胞逐漸向周圍分散，細胞之間間隙增大，周邊可見形狀不規(guī)則的單個細胞，分化3 d時，細胞進一步分散，分化至第7天，可觀察到ECs典型形態(tài)鋪路石狀的細胞產(chǎn)生(圖1)。

圖1 iPSCs向ECs分化不同時間點的細胞形態(tài)Fig 1 Images of iPSCs differentiated into ECs at different time points (scale bar=100 μm)

2.2 HPAH和CON來源 iPSCs分化不同時間點基因表達

分化過程中iPSCs標記基因NANOG和OCT4表達逐漸降低；中胚層標記基因Brachyury(T)表達先升高后降低，分化1.5 d達到峰值；VEGFR2表達逐漸升高且HPAH組高于CON組；內(nèi)皮細胞標記基因CD31表達升高，HPAH組分化5 d達到峰值；分化5 d時平滑肌標記基因α-SMA出現(xiàn)，HPAH組表達先升高后降低，CON組表達逐漸升高(圖2)。

2.3 ECs形態(tài)及表面分子標志鑒定

內(nèi)皮細胞表面分子標志CD31、CD146、VE-cadherin及vWF均為陽性，CON組無α-SMA表達，HPAH組iPSC-ECs有少量α-SMA表達(圖3)。

圖2 分化過程中不同時間點相關(guān)基因mRNA表達水平Fig 2 Relative mRNA expression profiling of relative genes at different time points during differentiation

A.images of CON and HPAH iPSC-ECs; B.immunofluorescence staining of iPSC-ECs圖3 CON和HPAH來源iPSC-ECs表面標志鑒定Fig 3 Identification of endothelial cell markers in CON and HPAH-derived iPSC-ECs(scale bare=100 μm)

2.4 EndoMT相關(guān)調(diào)控基因檢測

HPAH來源iPSC-ECs中，基因HMGA1、Slug和Snali1表達高于CON(圖4)。

2.5 HPAH和CON來源ECs成管功能比較

HPAH和CON來源iPSC-ECs均能形成管腔結(jié)構(gòu)，通過統(tǒng)計學分析，HPAH組成管數(shù)目、結(jié)點數(shù)目及成管長度均低于CON組(P<0.01)。VEGF165處理后HPAH組成管數(shù)目、結(jié)點數(shù)目及成管長度增加(P<0.05)(圖5)。

2.6 HPAH來源iPSC-ECs 中VEGFR2表達下調(diào)

HPAH來源iPSC-ECs中VEGER2的mRNA水平低于CON(P<0.01)(圖6A)。HPAH和CON組iPSC-ECs表面均有VEGFR2表達，但HPAH來源iPSC-ECs低于CON(圖6B)。

3 討論

近年來對于EndoMT的發(fā)生機制已有不少研究報道，野百合堿誘導的大鼠PAH模型中血管內(nèi)鈣黏蛋白(VE-cadherin)表達顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail和Slug增加[6]。PAH中EndoMT過程由HMGA1和下游的Slug調(diào)控[7]。那么HPAH來源iPSC-ECs是否存在同樣的現(xiàn)象呢？本研究中HPAH來源iPSC-ECs的α-SMA、HMGA1、Slug和Snail1等基因的mRNA水平高于CON，提示HMGA1、Slug和Snail1可能參與了調(diào)控iPSC-ECs的EndoMT過程。同時與CON相比HPAH來源的iPSC-ECs的成管存在缺陷，VEGF165可恢復其成管功能。在ECs分化過程中，HPAH中VEGFR2表達始終低于CON，猜測HPAH來源iPSC-ECs的成管缺陷可能是VEGF信號下調(diào)導致的。接著檢測了iPSC-ECs中VEGFR2的mRNA和細胞中的蛋白水平，結(jié)果HPAH來源iPSC-ECs中VEGFR2的表達低于對照。綜上，本研究表明HPAH來源的iPSC-ECs存在EndoMT現(xiàn)象和成管功能缺陷，HMGA1、Snail家族轉(zhuǎn)錄因子和VEGF通路可能參與對HPAH血管重構(gòu)的調(diào)控。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with CON圖4 CON和HPAH來源iPSC-ECs中基因α-SMA、HMGA1、Slug和Snail1表達Fig 4 Relative mRNA expression of α-SMA, HMGA1, Slug and Snail1 in CON and HPAH-derived iPSC-ECs

A.unstimulated CON-derived iPSC-ECs(×40); B.stimulated CON-derived iPSC-ECs with VEGF165(×40); C.unstimulated HPAH-derived iPSC-ECs(×40); D.stimulated HPAH-derived iPSC-ECs with VEGF165(×40); E,F,G.analysis of tube number, junction number and total branching lengths;*P<0.01 compared with control;#P<0.05 compared with unstimulated of VEGF165

A.VEGER2 mRNA expression, *P<0.01 compared with CON; B.immunofluorescence staining of VEGFR2(scale bar=100 μm)

由于遺傳因素和環(huán)境因素的影響，不同個體的ECs功能紊亂在HPAH中的發(fā)生機制可能有所差異，這可能成為逆轉(zhuǎn)PAH發(fā)展進程的障礙[8]。實驗結(jié)果表明HPAH患者來源iPSC-ECs表型和功能存在缺陷。通過進一步對不同患者來源iPSC-ECs進行表達譜分析，可能發(fā)現(xiàn)新的表達差異基因，從而為揭示PAH發(fā)病機制提供線索。并且將患者特異性iPSC-ECs作為研究對象，可為患者個體化治療方案的制定提供理論依據(jù)。

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