柳笑彥

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

巨噬細胞對外源刺激具有很強的表型可塑性和異質性。根據表型可將巨噬細胞分為經典激活的M1型(促炎)和選擇性激活的M2型(抗炎)。其表型變化是多種炎性反應性疾病發(fā)生、 發(fā)展和終止的調節(jié)因子。而炎性反應和代謝紊亂密切相關。因此， 調節(jié)巨噬細胞的表型為治療慢性炎性反應代謝性疾病提供了廣闊的前景[1- 3]。

雷公藤紅素(celastrol, Cel)，是一種天然三萜類化合物，是從中國傳統(tǒng)藥用植物雷公藤根皮中分離出的一種活性成分，在各種實驗模型中都表現出了有效的抗感染活性[4- 5]。雷公藤紅素對飲食誘導肥胖的小鼠脂肪和肝臟組織中M1/M2巨噬細胞極化分型有影響[6]，但其對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響尚不清晰。

本研究以小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，探討雷公藤紅素對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和Trizol試劑(Gibco公司)；IFN-γ、LPS、雷公藤紅素和牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich公司)；反轉錄試劑盒(ABI公司)；實時定量PCR試劑盒(Promega公司)；流式抗體APC anti-mouse F4/80、流式抗體PE anti-mouse CD11c、流式抗體APC anti-mouse CD206和流式試劑盒(BioLegend公司)；硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Merck公司)。

1.1.2 動物：6周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質量18～22 g[中國食品藥品檢定研究院，許可證號SCXK(京)2014- 0013]。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)及分組處理：腹腔灌肉湯法(刺激法)分離出小鼠腹腔巨噬細胞。將細胞進行如下分組并給予相應藥物處理：對照組(con，不作任何處理)、單純雷公藤紅素干預組(Cel，給予雷公藤紅素0.1 μmol/L)、經典激活M1組(IFN-γ+LPS，給予IFN-γ 20 μg/L和LPS 100 μg/L共同作用)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel，先給予IFN-γ 20 μg/L和LPS 100 μg/L共同作用，12 h后，再給予雷公藤紅素0.1 μmol/L作用)。無血清饑餓24 h后收樣進行后續(xù)實驗。

1.2.2 實時定量PCR檢測Arg- 1、iNOS、CD11c、CD206的mRNA表達水平：用Trizol提取細胞總RNA，測定濃度及純度后，按反轉錄試劑盒說明進行反轉錄并按實時定量PCR試劑盒說明配制PCR反應體系、運行反應程序。以β-actin為內參分析，所使用引物(表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.3 流式細胞儀檢測M1、M2巨噬細胞相關標志物CD11c、CD206：實驗設置組別：A1：對照組(Con)、單純雷公藤紅素干預組(Cel)、經典激活M1組(IFN-γ+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel) 4組細胞混合的對照(blank)。B1～B4：對照組(Con)、單純雷公藤紅素干預組(Cel)、經典激活M1組(IFN-γ+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel)4組細胞的F4/80和CD11c雙染。C1～C4：對照組(Con)、單純雷公藤紅素干預組(Cel)、經典激活M1組(IFN-γ+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel)4組細胞的CD11c和CD206雙染。取6孔板細胞置于冰上，用含1% BSA的PBS洗兩遍，每孔1 mL胰蛋白酶消化。5 min后每孔加等量的DMEM培養(yǎng)基終止消化，將細胞收集至相應已標記好的1.5 mL離心管中，1 000×g5 min離心，棄上清。每管沉淀用含1% BSA的PBS 1 mL溶解，吹打混勻，1 000×g5 min離心，棄上清。棄上清后每管約有100 μL的液體殘留，按實驗設置組別混好細胞，在殘留的含1% BSA的PBS細胞懸液里直接添加流式抗體：B1～B4組每管添加APC anti-mouse F4/80抗體和PE anti-mouse CD11c抗體各1 μL；C1～C4組每管添加PE anti-mouse CD11c抗體和APC anti-mouse CD206抗體各1μL。避光冰上孵育15～20 min。再用含1% BSA的PBS 1 000×g5 min洗兩遍，每管細胞用500 μL含1% BSA的PBS重懸，流式上機檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組Arg- 1、CD206、iNOS及CD11c的mRNA表達水平變化

各組Arg- 1、CD206、iNOS和CD11c的mRNA表達水平變化(圖1)。

單純雷公藤紅素干預組Arg- 1 mRNA表達水平有升高趨勢；經典激活M1組Arg- 1 mRNA表達水平有降低趨勢(圖1A)。加入雷公藤紅素后，M1型巨噬細胞的Arg- 1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(圖1A)。

經典激活M1組CD206 mRNA表達水平有降低趨勢；經雷公藤紅素干預后，M1型巨噬細胞的CD206 mRNA表達水平有升高趨勢(圖1B)。相較于經典激活M1組，單純雷公藤紅素干預組的巨噬細胞CD206 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(圖1B)。

單純雷公藤紅素干預組iNOS mRNA表達水平有非常顯著的降低(P<0.01)；經典激活M1組的iNOS mRNA表達水平則有非常顯著的升高(P<0.01)(圖1C)。加入雷公藤紅素后，M1型巨噬細胞的iNOS mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；相較于經典激活M1組，單純雷公藤紅素干預組的iNOS mRNA表達水平也有非常顯著的降低(P<0.01)(圖1C)。

A.Arg- 1 expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; B.CD206 expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; C.iNOS expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; D.CD11c expressional level of control, Cel group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with IFN-γ+LPS group

單純雷公藤紅素干預組CD11c mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)(圖1D)。

2.2 各組F4/80+CD11c+ 細胞比例

雷公藤紅素能使M1型巨噬細胞比例降低(X軸為APC標記的F4/80，代表泛巨噬細胞；Y軸為PE標記的CD11c，代表M1型巨噬細胞)(圖2)。

2.3 各組CD11c+CD206- 細胞比例

雷公藤紅素能使M1型巨噬細胞比例降低；M2型巨噬細胞比例太低，無法染上(X軸為APC標記的CD206，代表M2型巨噬細胞；Y軸為PE標記的CD11c，代表M1型巨噬細胞)(圖3)。

3 討論

近年來，肥胖等代謝綜合征和與肥胖相關的代謝性疾病在全球范圍內日益增加，已經成為嚴重影響人們健康、經濟和生活的主要問題[7]。慢性低度炎性反應與肥胖和代謝綜合征有關，在代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。巨噬細胞炎性浸潤就是代謝性疾病炎性反應環(huán)境的特點之一[8]。經典激活的巨噬細胞(M1)促進脂肪組織炎性反應和胰島素抵抗，而選擇性激活的巨噬細胞(M2)阻止肥胖和胰島素抵抗[9]。在這種情況下，調節(jié)巨噬細胞的極化，改變M1/M2巨噬細胞的比例，為肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病的治療提供了新的靶點和思路。本研究顯示，雷公藤紅素能抑制小鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化。

中藥活性成分和分子靶點的鑒定是現代藥理學的巨大機遇。雷公藤紅素就是這樣一種最初從中藥中鑒別出來的化合物。它是一種三萜甲基化合物，是存在于雷公藤根提取物的藥理活性成分，已被證明具有抗炎作用，一般用于治療炎性反應和自身免疫性疾病。雷公藤紅素因其潛在的抗炎和抗癌活性而引起了極大的關注，被認為是從傳統(tǒng)中藥的植物提取物中分離出來的最有前途的藥物分子[10]。雷公藤紅素在單核細胞、巨噬細胞、白細胞中等能夠抑制脂多糖、干擾素c、雙鏈RNA誘導的炎性反應的各種介質[11]。但其對促炎的M1型巨噬細胞和抗炎的M2型巨噬細胞極化分型的影響尚不清晰。在本研究中，雷公藤紅素能促使M1型巨噬細胞相應標志物CD11c、iNOS表達減少，能使M2型巨噬細胞相應標志物Arg- 1表達增加，表明雷公藤紅素能通過調節(jié)巨噬細胞的極化，改變M1/M2巨噬細胞的比例以發(fā)揮抗炎作用。

A.proportion of F4/80+CD11c+cells of control group; B.proportion of F4/80+CD11c+cells of Cel group; C.proportion of F4/80+CD11c+cells of IFN-γ+LPS group; D.proportion of F4/80+CD11c+cells of IFN-γ+LPS+Cel group

圖2對照、Cel、IFN-γ+LPS和IFN-γ+LPS+Cel各組F4/80+CD11c+細胞比例的比較
Fig2ComparisonofproportionofF4/80+CD11c+cellsofcontrol,Cel,IFN-γ+LPSandIFN-γ+LPS+Celgroup

A.proportion of CD11c+CD206-cells of control group; B.proportion of CD11c+CD206-cells of Cel group; C.proportion of CD11c+CD206-cells of IFN-γ+LPS group; D.proportion of CD11c+CD206-cells of IFN-γ+LPS+Cel group

圖3對照組、Cel、IFN-γ+LPS和IFN-γ+LPS+Cel各組CD11c+CD206-細胞比例的比較
Fig3ComparisonofproportionofCD11c+CD206-cellsofcontrol,Cel,IFN-γ+LPSandIFN-γ+LPS+Celgroup

參考文獻：

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