蔡向杰，屈云萍，王亞濤，李 哲，姜國志

1神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051400；2中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室

枳椇為鼠李科(Rhamnaceae)拐棗屬(Hovenia Thunb.)落葉喬木，始載于《唐本草》，又名拐棗、金鉤子、甜半夜等。枳椇子系枳椇植物干燥成熟的種子，有清熱利尿，解酒毒之功效，主治煩熱、口渴、嘔吐、二便不利等癥。枳椇子應(yīng)用歷史悠久，是國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食同源植物之一，其主要化學(xué)成分包括:皂苷、糖苷、生物堿、黃酮類化合物、脂肪酸及其他微量成分［1-4］。許多學(xué)者研究認(rèn)為枳椇子的療效與其所含成分的抗氧化作用密切相關(guān)，其中以黃酮類和皂苷類物質(zhì)尤為重要。枳椇子作為藥食同源的中藥之一，具有良好的發(fā)展前景，其有效成分的提取和純化對枳椇子的質(zhì)量控制意義重大。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是利用合理的設(shè)計(jì)并通過試驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次逐步回歸方差擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程分析尋找最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法［5-10］，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥材提取工藝研究中［11-13］。實(shí)驗(yàn)以指標(biāo)成分(皂苷含量、總黃酮含量及干膏收率)的綜合得分為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法建立多元二次回歸方程，用以優(yōu)化枳椇子的提取工藝，為其開發(fā)和應(yīng)用及質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)來源，為其產(chǎn)業(yè)化提取數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試藥 枳椇子藥材購于安國市振宇中藥材飲片有限公司，產(chǎn)地湖南，批號：150608。經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠老師檢驗(yàn)鑒定為鼠李科(Rhamnaceae)拐棗屬(Hovenia Thunb.)枳椇藥材的種子。蘆丁對照品(純度92.5%)購自中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格100 mg/支，批號：100080-200707。乙醇、乙醚、正丁醇等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 METTLER-ALC-210.4電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；HC-400Y2粉碎機(jī)；紫外可見分光光度計(jì)；HH-SB型電熱恒溫水浴鍋(科偉儀器)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 將枳椇子用粉碎機(jī)粉碎至40～60目，混勻密封備用。

1.3.2 皂苷含量和總黃酮含量的提取 精密稱定一定量的枳椇子粉末，加入一定溶劑配成料液，在一定溫度下提取一定的時間，提取液過濾濃縮成干膏粉。

1.3.3 總黃酮的含量測定［14］精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品50 mg，置于100 mL量瓶中，用80%乙醇溶解并定容。精密量取上述對照品溶 液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分 別 置 入25 mL量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6分鐘，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻；放置6分鐘，加入4%NaOH溶液10.0 mL，用80%乙醇稀釋至刻度，混勻。放置15分鐘在500 nm波長處，以相應(yīng)試劑作空白，分別測吸收度。以吸收度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4皂苷的含量測定［15］取枳椇子干膏粉約0.5 g，精密稱定，用水20 mL分次溶解并洗入分液漏斗中。用乙醚分次振搖脫脂，每次20 mL，至乙醚層無色，棄去乙醚洗液。用水飽和正丁醇分次振搖提取，每次20 mL，至正丁醇層無色，合并正丁醇提取液于已知重量蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，105℃干燥至恒重，稱重，計(jì)算。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 提取時間對結(jié)果的影響 稱取枳椇子粉末1.0 g，以純化水作為溶劑提取1次，分別提取1、2、3、4、5、6 h，按照“1.3.3 項(xiàng)”及“1.3.4 項(xiàng)”的方法進(jìn)行測定。

1.4.2 提取次數(shù)對結(jié)果的影響 稱取枳椇子粉末 1.0 g，以純化水作為溶劑，分別提取 1、2、3、4、5、6次，每次提取 1 h，按照“1.3.3項(xiàng)”及“1.3.4項(xiàng)”的方法進(jìn)行測定。

1.4.3 溶劑倍量對結(jié)果的影響 稱取枳椇子粉末 1.0 g，分別加入 5、6、7、8、9、10 倍量純化水提取1次，提取2小時，按照“1.3.3項(xiàng)”及“1.3.4項(xiàng)”的方法進(jìn)行測定。

1.5 響應(yīng)面分析因素水平的選取和設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出顯著性影響因素后，以顯著性影響因素(提取時間、提取次數(shù)、溶劑倍量)作為考察因子，優(yōu)化枳椇子的提取工藝。響應(yīng)曲面因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 綜合評價指標(biāo)和權(quán)重的選擇 以提取時間、提取次數(shù)、溶劑倍量為因素，每個因素選3個水平，以干膏收率與干膏中總黃酮含量、皂苷含量為指標(biāo)，根據(jù)指標(biāo)間的重要性差異給出各指標(biāo)的權(quán)重，確定綜合評分=干膏收率×30+干膏中總黃酮含量×40+ 干膏中皂苷含量×30［16］。

2.2 提取溶劑的選擇［17-18］目前文獻(xiàn)中報(bào)道，枳椇子提取方式有水提和70%醇提。所以本實(shí)驗(yàn)分別加入5倍的純化水和70%乙醇，提取2次，每次2小時，旨在對枳椇子提取方式進(jìn)行考察分析。結(jié)果表明，水提皂苷含量為4.15%，總黃酮含量為4.26%，收率為6.86%。而醇提皂苷含量為3.57%，總黃酮含量為3.88%，收率為4.97%。按2.1進(jìn)行綜合評分后結(jié)果為：水提綜合評分為5.007，而醇提綜合評分為4.114?？梢娝醿?yōu)于醇提，所以提取溶劑最終確定為純化水。

2.3 繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.3.3繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為A=0.038 65C-0.00119，R=0.9999，線性范圍 5.11～25.55mg/L。2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 提取時間對結(jié)果的影響 稱取枳椇子粉末1.0 g，以純化水作為溶劑提取1次，分別提取1、2、3、4、5、6 次，按照“1.3.3 項(xiàng)”及“1.3.4 項(xiàng)”的方法進(jìn)行測定，并根據(jù)2.1中方法對結(jié)果進(jìn)行綜合評分。提取時間為1～3小時隨著提取時間的延長，得分逐漸增加，當(dāng)提取時間達(dá)到3 h時得分最高。繼續(xù)提取，綜合得分反而下降，并在提取5 h時趨于平穩(wěn)。原因是隨著提取時間的延長，產(chǎn)生了大量雜質(zhì)，使得收率雖有所增加，但2個含量均大大下降使得分下降。因此，綜合考慮將提取時間定為3小時最合適。見圖1。

2.4.2 提取次數(shù)對結(jié)果的影響 稱取枳椇子粉末 1.0 g，以純化水作為溶劑，分別提取 1、2、3、4、5、6次，每次提取 1 小時，按照“1.3.3項(xiàng)”及“1.3.4項(xiàng)”的方法進(jìn)行測定，并通過“2.1項(xiàng)”對結(jié)果進(jìn)行綜合評分。提取次數(shù)為1～3次時隨著提取次數(shù)的增加，得分逐漸增加。增加提取次數(shù)得分反而下降，并趨于平穩(wěn)。原因是提取4次時已經(jīng)將有效成分完全提取，再增加提取次數(shù)導(dǎo)致提取出雜質(zhì)，影響了綜合得分，所以將提取次數(shù)定為3次最為合適。見圖2。

2.4.3 溶劑倍量對結(jié)果的影響 稱取枳椇子粉末 1.0 g，分別加入 5、6、7、8、9、10 倍量純化水提取 1次，提取 2小時，按照“1.3.3項(xiàng)”及“1.3.4項(xiàng)”的方法進(jìn)行測定，并通過“2.1項(xiàng)”對結(jié)果進(jìn)行綜合評分。溶劑倍數(shù)5～8倍時得分逐漸增加，當(dāng)溶劑量為8倍時得分最高，這是因?yàn)樘崛∪軇┑脑黾邮顾幉某浞值慕幔欣谟行С煞值慕?，但?dāng)溶劑達(dá)8倍量時，含量幾乎達(dá)到飽和。再繼續(xù)加大溶劑量，雖收率有所增高，但因浸出了雜質(zhì)導(dǎo)致最終評分下降。因此，綜合考慮將溶劑量定為8倍量較為合適。見圖3。

圖1 提取時間的影響

2.5 回歸模型的建立和分析 利用Design-Expert 8.0.6對下表數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立枳椇子提取工藝參數(shù)的回歸模型，得到總黃酮含量、皂苷含量及收率綜合得分編碼自變量A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程：方程Y=0.014 A+0.56B+0.46C-0.30AB+0.007 5AC-0.49BC+0.038 A2-0.37B2-0.29C2+8.28。對于該模型進(jìn)行方差分析和模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

圖2 提取次數(shù)的影響

圖3 溶劑倍量的影響

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，可見回歸模型極其顯著(P＜0.01)，說明建立的模型有意義；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型擬合度良好，隨機(jī)產(chǎn)生的模型的殘差可以不計(jì)，可用此模型和方程來分析預(yù)測枳椇子總黃酮含量、皂苷含量及收率的綜合得分。結(jié)果見表3。

模型由方差分析結(jié)果可知，對回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，模型的矯正系數(shù)R2Adj為0.981 9，說明此模型能解釋98.19%響應(yīng)值的變化，即此數(shù)據(jù)擬合度很高，試驗(yàn)誤差小，因此可以用于枳椇子提取工藝的分析和預(yù)測?；貧w模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果中可以看出，模型的一次項(xiàng)中B、C影響顯著，二次項(xiàng)B2影響顯著，其他各項(xiàng)對綜合得分的影響不是簡單的線性關(guān)系［19］。

2.6 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面圖是根據(jù)回歸方程繪制的，是響應(yīng)值在各實(shí)驗(yàn)因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個三維空間曲面，可以預(yù)測和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量的相互關(guān)系。AB、AC和BC之間均存在交互作用，根據(jù)回歸方程做出模型的響應(yīng)曲面及等高線見圖4。

表3 回歸模型和方差分析

圖4 等高線和響應(yīng)面圖

利用Design-Expert 8.0.6軟件求解回歸方程。最高綜合得分為8.787 55，其最優(yōu)提取條件為提取時間為2.00 h，提取次數(shù)為4.00次，溶劑倍量為7.86倍，此條件下得到皂苷含量為8.910 1%，總黃酮含量為6.420 7%，干膏收率為11.820 8%，綜合得分8.787 56。

2.7 最佳提取工藝確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了方便，將提取時間定為2小時、提取次數(shù)4次、溶劑倍量定為8倍量，依據(jù)所確定的最佳提取工藝進(jìn)行實(shí)際驗(yàn)證(n=3)，實(shí)際測的枳椇子皂苷平均含量8.879 7%(RSD=1.4%)，總黃酮平均含量為6.452 1%(RSD=0.8%)，干膏收率為11.117 9%(RSD=0.5%)，綜合評分為8.580 12，這與理論預(yù)測值(8.787 56)接近；因此，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的得到得枳椇子提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)曲面法，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到枳椇子皂苷含量、總黃酮含量和干膏收率與提取時間、提取次數(shù)和溶劑倍量關(guān)系的回歸模型。最終得出最優(yōu)提取工藝條件為提取時間2小時、提取次數(shù)4次、提取溶劑8倍量，此條件下得到皂苷含量為8.910 1%，總黃酮含量為6.420 7%，干膏收率為11.820 8%。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，通過將多指標(biāo)綜合評分能夠篩選以多個目標(biāo)成分在同一提取條件下的提取工藝并進(jìn)行綜合評價，兼顧各指標(biāo)的協(xié)同效應(yīng)，減少了單因素分別試驗(yàn)的局限性，比單一指標(biāo)篩選更為科學(xué)、全面，能夠提高提取效率，減少服用劑量、提高療效要求，更可以保證制劑的質(zhì)量［20］。

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