霍 堅 ，王海偉 ，王自勤，蘇 丹，呂宏迪△

1解放軍第一五九醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2河南省武警總隊醫(yī)院

高原急性缺氧易引起腦損傷，對當(dāng)?shù)鼐用竦纳眢w健康危害嚴(yán)重，但其發(fā)生的分子機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多［1-3］。闡明高原急性缺氧引起腦損傷的分子機(jī)制，探尋有效的臨床治療靶點(diǎn)和預(yù)防治療方案，是目前本領(lǐng)域國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。參茸益精片主要由西洋參、黃芪等藥物藥組成，具有復(fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肝，生津養(yǎng)血，安神益智壯腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常規(guī)治療后以及腫瘤患者放化療后白細(xì)胞減少，血紅蛋白低，高原反應(yīng)及消化不良等癥［4-6］。但參茸益精片對于高原缺氧造成的腦損傷是否具有保護(hù)作用，其具體分子機(jī)制如何，目前尚未見相關(guān)報道。本實驗以大鼠高原缺氧腦損傷動物模型為研究對象，通過Western blot和RT-PCR等實驗，觀察Caspase-3和Caspase-9蛋白和mRNA表達(dá)的變化，分析并闡明參茸益精片腦損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模型建立 SD大鼠18只，體質(zhì)量(180～200g)，由解放軍一五九醫(yī)院實驗動物中心提供，動物實驗合格證號：DWZX2016032，隨機(jī)分為空白對照組，模型組對照組和參茸益精片治療組，每組均為6只，通過低壓氧艙建立高原缺氧動物模型?？瞻讓φ战M大鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)(由動物中心提供，總熱量為11.2KJ/g)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境維持在25℃溫度和50%濕度，明暗周期12小時/12小時；通過低壓氧艙建立高原缺氧動物模型后，模型組對照組大鼠在上述飼養(yǎng)環(huán)境中，給予常規(guī)飼料并自由飲水，而治療組動物在給予上述處理的同時，口服灌胃參茸益精片0.5mg/kg。8周后，檢測各組大鼠腦部相關(guān)指標(biāo)變化。

1.2 Caspase-9和Caspase-3活性檢測 取大鼠腦組織，PBS沖洗，按Caspase活性檢測試劑盒操作程序，加入裂解液，機(jī)械勻漿處理，1500 r/min離心20分鐘，取上清，加入Ac-LEHD-pNA，室溫放置1小時，測定吸光度值(405 nm)。

1.3 Western blot分析Caspase-3和Caspase-9表達(dá) 取大鼠腦組織，PBS沖洗，加入裂解液，機(jī)械勻漿處理，離心30分鐘，12 000 r/min。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉孵育1小時，封閉非特異性背景染色，再分別加入Caspase-3和Caspase-9一抗(1∶1000)孵育，4℃過夜后，與二抗室溫孵育2小時。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，收集圖像，Caspase-3和Caspase-9抗體均購自美國Abcam公司。

1.4 RT-PCR分析Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá) 分別取大鼠肝臟和主動脈組織，Tzail法提 取 總 RNA，通 過 RT-PCR分 析 Caspase-3和Caspase-9mRNA水平的變化。Tzail試劑購自美國invitrogen公司。Caspase-3上游引物：5′-CAGACAGTGGAACTGACGAT-3′，下 游 引 物 ：5′-TTTCAGCATGGCGCAAAGTG-3′；Caspase-9 上游引物 5′-CAGTGGGCTCACTCTGAAGACC-3′，下 游 引 物5′-ACGCGTTACTGGCATTGAGG-3′；β-actin 上游引物：5′-GAAGTGTGACGTTGACAT CCG-3′，β-actin 下游引物:5′-GCCTAGAAGCATTTGCGGTG-3′，引物由上海碧云天生物技術(shù)公司設(shè)計。瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離RT-PCR產(chǎn)物(Bio-Rad公司電泳儀)，凝膠成像儀觀察圖像，分析組間差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組間差異采用t檢驗比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9活性的影響 高原缺氧造成腦損傷后，與空白對照組相比較，大鼠腦組織中大鼠肝臟中Caspase-3和Caspase-9活性顯著增加(P＜0.05)。參茸益精片治療組的動物，與模型組相比，Caspase-3和Caspase-9活性均顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9活性的影響

2.2 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響 與空白對照組相比較，模型組動物腦組織中Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)；參茸益精片治療組的動物，與模型組相比，腦組織中Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。見圖1。

圖1 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

2.3 參茸益精片對高原缺氧腦損傷大鼠Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響 模型組大鼠，與空白對照組相比較，腦組織中Caspase-3和Caspase-9表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，而經(jīng)過參茸益精片治療的動物，與模型組相比，腦組織中Caspase-3和Caspase-9表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。見圖2。

圖2 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響

3 討論

參茸益精片的主要有效成分是人參皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re 和黃芪甲苷(Astragaloside A)，具有復(fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肝，生津養(yǎng)血的功效，可以達(dá)到疏通脈管，改善臟器供血，調(diào)節(jié)人體代謝功能的目的［7-8］。高原急性缺氧易引起腦損傷，在高原地區(qū)的臨床發(fā)病率持續(xù)增高，其發(fā)生的分子機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多。分析并闡明參茸益精片保護(hù)高原急性缺氧引起的大鼠腦損傷的分子機(jī)制，將為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究中，我們通過建立大鼠高原急性缺氧模型，觀察參茸益精片對缺氧大腦的保護(hù)作用，以闡明參茸益精片的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3和Caspase-9與大鼠高原急性缺氧造成的腦損傷密切相關(guān)，與空白對照組相比較，高原急性缺氧模型大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9表達(dá)均明顯增加，參茸益精片治療組的動物，與模型組相比，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)均顯著降低。通過RT-PCR實驗，上述分子的mRNA表達(dá)水平也體現(xiàn)一樣的趨勢。以上結(jié)果提示，參茸益精片具有顯著的腦保護(hù)作用，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，參茸益精片能夠顯著高原急性缺氧模型大鼠腦組織相關(guān)分子的表達(dá)，可能作為臨床治療并預(yù)防急性缺氧腦損傷的藥物。

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