高 路

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)門診部，遼寧 沈陽 110035

綠茶提取物(green tea extract，GTE)是一種從綠茶葉片中提取的活性成分，主要含有茶多酚(兒茶素)等活性物質(zhì)，臨床應(yīng)用具有抗氧化、清除自由基、殺菌解毒、解酒保肝等作用［1］?，F(xiàn)代研究證實［2］，綠茶提取物中的茶多酚能夠抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，促使突變DNA斷裂，阻止腫瘤細(xì)胞的合成，從而抑制腫瘤的生長及增殖?？谇话┦且环N威脅人類健康的惡性腫瘤疾病，其中大部分屬于口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，患者口腔出現(xiàn)黏膜白斑、表面粗糙［3］，隨著疾病的進(jìn)展，可轉(zhuǎn)化為乳頭狀或潰瘍型［4］，或混合出現(xiàn)。其中早期的口腔鱗癌即出現(xiàn)癌細(xì)胞對周圍組織的浸潤與擴散或者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［5］，臨床治療相對困難且預(yù)后差，嚴(yán)重威脅患者的生命健康?，F(xiàn)代研究顯示，綠茶提取物能夠抑制口腔鱗癌細(xì)胞株的增殖作用，并影響其細(xì)胞周期［6］。因此本文利用口腔鱗癌模型大鼠，探究綠茶提取物對口腔鱗癌模型大鼠抗腫瘤組織中EphA2、EphrinA1和E-cadherin表達(dá)影響，探討綠茶提取物對口腔鱗癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)(規(guī)格：1 g，上海子起生物科技有限公司，批號：Z26147501)綠茶提取物(規(guī)格：5 g，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司有限公司，批號：20150829)本品采用溶劑提取法獲取，并將綠茶提取物溶于備好的蒸餾水內(nèi)，配置為濃度10 mg/mL的溶液，常溫下渦旋1分鐘，置于37℃進(jìn)行孵育，1小時后進(jìn)行離心，5 000 r/min，離心時間為10分鐘，取上清液，除去未溶解物質(zhì)，采用過濾器對上清液進(jìn)行過濾，培養(yǎng)基稀釋至濃度為100 μg/mL；Phospho-EphA2(Tyr594)磷酸化酪氨酸蛋白激酶A2受體抗體(上海喬羽生物科技有限公司)；Ephrina1內(nèi)皮細(xì)胞受體蛋白酪氨酸激酶A抗體(腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白4)(上海喬羽生物科技有限公司)；E鈣黏著蛋白/上皮性鈣黏附蛋白(E-Cad)ELISA試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司)；LEICA CM1550S冰凍切片機(河北藍(lán)夢生物醫(yī)藥科技有限公司)；Butyl-S-QZT 6FF光學(xué)顯微鏡［江蘇中科森輝微球(原國家生化中心)］；CI-400計算機圖像分析系統(tǒng)，北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 選擇45只健康Wistar大鼠，雌雄各半，均為8周齡，平均體質(zhì)量(200±20)g，由北京艾德摩生物技術(shù)有限公司提供。醫(yī)動字第19-056號，動物實驗許可證號：SYXK(京)2015-0026。將45只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組以及綠茶提取物組，每組各15只。分籠飼養(yǎng)，大鼠使用的籠具、飼料以及墊料等均高壓消毒，能夠正常自由飲食飲水，大鼠應(yīng)用物品每隔3日消毒一次。適應(yīng)性喂養(yǎng)7日，實驗室溫度維持于23℃左右。

1.2.2 模型建立［7］所有大鼠用藥前均禁食水10小時。正常對照組正常飼養(yǎng)，模型對照組以及綠茶提取物組給予4-NQO以建立口腔鱗癌的動物模型，2組大鼠給予4-NQO(用無菌蒸餾水配制成0.1%濃度)5 g/L涂于口腔腭黏膜上，每2日涂抹1次，連續(xù)涂抹28周，正常對照組不涂抹，給予各組大鼠正常顆粒食物以及充足自來水進(jìn)行喂養(yǎng)。1.2.3 給藥方法 綠茶提取物組于模型建立后開始給予綠茶提取物50 mg混合成10 mL溶液，每日分2次灌胃，給藥8周。其余2組給予生理鹽水灌胃，劑量與使用頻率和綠茶提取物組相同至實驗結(jié)束。每日喂養(yǎng)全價飼料，自由飲水，保證充足飲水，維持人工排尿3次。

1.2.4 指標(biāo)觀察 研究期間，觀察并記錄大鼠活動、飲食飲水以及毛色情況，稱體質(zhì)量。8周后，取大鼠上腭部分病變黏膜組織，應(yīng)用10%的中性甲醛溶液對其進(jìn)行固定，處理組織，石蠟包埋制備4 μm厚連續(xù)切片，梯度酒精進(jìn)行脫水，檸檬酸抗原修復(fù)，以及分?jǐn)?shù)10%H2O2去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，采用免疫組化法檢測腫瘤組織EphA2、EphrinA1以及E-cadherin蛋白水平。EphA2以及EphrinA1的陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)，呈散在或者密集的棕黃色顆粒；E-cadherin的陽性染色定位于胞質(zhì)或者細(xì)胞核，主要存在于胞質(zhì)染色，呈散在或者密集的棕黃色顆粒。采用CI-400計算機圖像分析系統(tǒng)，于光學(xué)顯微鏡下觀察整張切片，尋找染色清晰、陽性細(xì)胞分布廣的區(qū)域，并于每張切片中隨機選擇 5個不同視野，EphA2、EphrinA1以及E-cadherin蛋白的表達(dá)水平為觀察所得的在同一光強度下測量陽性信號的平均光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以(±s)表示，蛋白水平的表達(dá)采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較方法為單因素方差法，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠情況 實驗過程中嚴(yán)格無菌操作，其中正常對照組無大鼠死亡，模型對照組大鼠4只死亡，死亡發(fā)生率為26.67%；綠茶提取物組1只死亡，死亡發(fā)生率為13.33%。正常對照組大鼠毛色光亮，活動正常，能夠正常飲水飲食，平均體質(zhì)量(203.48±21.63)g；模型對照組大鼠毛色暗啞，活動度顯著降低，舌背中部出現(xiàn)灰白色外生性腫物，牙齦、口底、腭部以及唇部等部位均發(fā)現(xiàn)類似腫物或潰瘍，質(zhì)地較硬，活動度差，與周圍組織粘連，進(jìn)食困難，平均體質(zhì)量(167.49±19.19)g；綠茶提取物組造模期間大鼠毛色暗啞，但應(yīng)用綠茶提取物灌胃后，部分大鼠毛色恢復(fù)光亮，癥狀有所緩解，活動正常，舌背根部至舌尖部僅出現(xiàn)部分白色斑塊，飲食飲水正常，平均體質(zhì)量(22.40±2.29)g。

2.2 各組大鼠 EphA2、EphrinA1及 E-cadherin蛋白表達(dá)水平 治療后，與正常對照組相比，模型對照組以及綠茶提取物組EphA2、EphrinA1平均光密度水平較高(P＜0.05)，E-cadherin平均光密度水平較低(P＜0.05)；與模型對照組相比，綠茶提取物組EphA2、EphrinA1平均光密度較低(P＜0.05)，E-cadherin平均光密度較高(P＜0.05)。見表 1、圖 1—9。

表1 各組大鼠EphA2、EphrinA1及E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表1 各組大鼠EphA2、EphrinA1及E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較(±s)

注：*表示與正常對照組比較，P＜0.05；#表示與模型對照組比較，P＜0.05

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圖1 正常對照組EphA2的表達(dá)情況

圖2 模型對照組EphA2的表達(dá)情況

圖3 綠茶提取物組EphA2的表達(dá)情況

圖4 正常對照組EphrinA1的表達(dá)情況

圖5 模型對照組EphrinA1的表達(dá)情況

圖6 綠茶提取物組EphrinA1的表達(dá)情況

圖7 正常對照組E-cadherin的表達(dá)情況

圖8 模型對照組E-cadherin的表達(dá)情況

圖9 綠茶提取物組E-cadherin的表達(dá)情況

3 討論

OSCC是世界五大常見的惡性腫瘤之一［8］，已超過口腔顎面部惡性腫瘤患病總數(shù)的80%［9］?；颊呖谇粺o明顯原因的反復(fù)出血、麻木感，本病5年內(nèi)生存率僅為50%左右［10］，本病的發(fā)病與日?？谇恍l(wèi)生習(xí)慣、不良的口腔黏膜刺激以及吸煙喝酒等不良嗜好具有相關(guān)性，且與種族有關(guān)。隨著臨床研究的不斷進(jìn)展，OSCC的治療水平不斷提高，預(yù)后明顯改善，但是其早期診斷及遠(yuǎn)期療效并不理想。又由于OSCC發(fā)生隱匿，發(fā)展過程緩慢，致病因素較多且發(fā)病機制尚未明確，但本病的發(fā)病受抑癌及原癌基因表達(dá)的影響。GTE是近年來發(fā)現(xiàn)的天然抗氧化劑，不僅在抗氧化方面療效佳，針對腫瘤的治療也具有顯著療效。劉曉亮等［11］研究發(fā)現(xiàn)，綠茶提取物對不同的人口腔鱗癌細(xì)胞株通過對細(xì)胞周期S期及G2/M期阻滯從而起抗腫瘤效應(yīng)，預(yù)防口腔鱗癌的發(fā)生。此外，綠茶提取物能夠通過減輕氧化應(yīng)激損傷［12］，從而保護(hù)急性肝損傷。

酪氨酸蛋白激酶受體(RTK)是一種跨膜傳導(dǎo)信號的主要成分，對細(xì)胞的生長、分化以及遷移具有調(diào)控作用。Eph受體是RTK中最大的I型跨膜糖蛋白家族成員，與其配體Ephrin具有相互作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞間的連接以及黏附，使其正常表達(dá)。現(xiàn)代研究顯示，于正常上皮細(xì)胞內(nèi)EphA2以及EphrinA1相結(jié)合，產(chǎn)生自身磷酸化以及降解作用，但兩者表達(dá)水平較低［13］；而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)EphA2以及EphrinA1無法結(jié)合，細(xì)胞間黏附力降低，堆積于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，無法降解，表達(dá)水平較高［14］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，EphA2、EphrinA1 隨著口腔黏膜的發(fā)展水平升高［15］。E-cadherin是細(xì)胞間黏附分子，參與EphA2以及EphrinA1的調(diào)控，間接調(diào)控EphA2的蛋白表達(dá)水平。有研究顯示，E-cadherin在正常組織中表達(dá)水平較高，而隨著口腔黏膜組織的惡行性轉(zhuǎn)化其表達(dá)水平隨之降低［16］。本研究結(jié)果表明，治療后，與正常對照組相比，模型對照組以及綠茶提取物組EphA2、EphrinA1平均光密度水平較高，E-cadherin平均光密度水平較低；與模型對照組相比，綠茶提取物組EphA2、EphrinA1平均光密度較低，E-cadherin平均光密度較高。證實綠茶提取物能夠下調(diào)癌癥組織EphA2、EphrinA1表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平，抑制口腔鱗癌的發(fā)展。

綜上所述，綠茶提取物能夠改善口腔鱗癌模型大鼠癥狀，阻止癌細(xì)胞生長，可能與下調(diào)癌癥組織EphA2、EphrinA1表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平有關(guān)。

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