程 莉，譚婷婷，魏紅霞，張 葵

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 210008)

肺炎克雷伯菌是臨床分離及醫(yī)院感染重要的條件致病菌之一，常引起重癥肺炎，還可引起泌尿道感染、膽道感染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病[1]，其發(fā)病率和病死率較高。目前研究數(shù)據(jù)表明其對第3代頭孢菌素的耐藥率高達40.0%～70.0%，由于多重耐藥細菌的出現(xiàn)，作為治療腸桿菌科細菌感染“最后一道”防線的碳青霉烯類抗菌藥物正被廣泛應(yīng)用于治療此類細菌引起的感染，從而引起耐碳青霉烯腸桿菌科細菌，尤其是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的大量出現(xiàn)，并在全球范圍內(nèi)的廣泛播散，對公共健康衛(wèi)生造成了極大的威脅。本研究探討了本院2014年臨床分離的CRKP的耐藥機制，旨在為臨床預(yù)防及控制CRKP的進一步產(chǎn)生及播散提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集本院2014年1-12月臨床分離的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株，所有菌株均經(jīng)法國生物梅里埃ATB細菌鑒定儀或Vitek 2 Compact 全自動細菌鑒定儀鑒定菌株。

1.2儀器與試劑 藥敏紙片為Oxiod公司產(chǎn)品；PCR引物由Invitrogen公司合成；2×PCRMasterMix、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京天根公司；ATB細菌鑒定儀和Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司。PCR擴增儀購于愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易(上海)有限公司，羰酰氰氯苯腙(CCCP)試劑購于Sigma aldrich公司，SDS-PAGE所用分離膠和濃縮膠為碧云天公司產(chǎn)品。

1.3藥敏試驗 采用紙片擴散法(K-B法)或者Vitek 2 Compact全自動藥敏分析系統(tǒng)[最小抑菌濃度(MIC)法]初篩亞胺培南不敏感菌株，瓊脂稀釋法確證亞胺培南不敏感肺炎克雷伯菌。結(jié)果判讀參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI) 2015年推薦的標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗使用的質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922購自國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.4Carba NP確證試驗 用接種環(huán)挑取一接種環(huán)的待測細菌(瓊脂稀釋法確定為亞胺培南不敏感的肺炎克雷伯菌)，分別在加入含有100 mL細菌總蛋白抽提試劑的“a”和“b”離心管中乳化，震蕩5 s。在兩管中分別加入100 mL的A液和B液，混勻，(35±2) ℃孵育2 h，結(jié)果根據(jù)2015年CLSI的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。

1.5耐藥基因檢測 對所收集菌株進行碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA、blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaSIM、blaDIM、blaBIC)檢測，不產(chǎn)碳青霉烯酶基因的菌株進行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(ESBLs)(blaTEM、blaCTX-M、blaSHV)，質(zhì)粒攜帶的AmpC基因(blaGES、blaPER、blaVEB、blaACC、blaFOX、blaMOX、blaCIT、blaEBC、blaDHA)檢測。水煮法提取細菌基因組DNA，取2 μL上清液作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中，2×PCR混合標(biāo)記物為25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各2 μL。引物序列參照文獻產(chǎn)物[2-3]。經(jīng) 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外成像觀察結(jié)果，收集可疑PCR陽性產(chǎn)物送上海美吉有限公司進行測序，所得到的測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行在線BLAST比對以確定。

1.6外膜蛋白SDS-PAGE 采用超速破壁法制備11株不產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌外膜蛋白，其中不溶于月桂酰基氨基酸鈉的蛋白組分即為外膜蛋白樣品，將其加入10%聚丙烯酰胺分離膠中進行SDS-PAGE電泳分析，最后用考馬斯亮藍染色。其中標(biāo)準(zhǔn)菌株為 ATCC 13883。

1.7外排泵抑制劑CCCP抑制試驗 用CCCP抑制試驗分析11株不產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌是否存在對碳青霉烯類抗菌藥物主動外排現(xiàn)象。同時制備不含CCCP和含有50 μmol/L CCCP的亞胺培南、美羅培南、厄他培南梯度濃度(0.125～64.000 μg/mL倍比稀釋)的M-H瓊脂平板，測定細菌MIC。以加入泵抑制劑后MIC值比不加泵抑制劑降低至≤1/4作為外排泵表型陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗及Carba NP確證試驗結(jié)果 K-B法或者MIC法初篩亞胺培南不敏感性菌株為35株，經(jīng)瓊脂稀釋法確證亞胺培南不敏感肺炎克雷伯菌為30株。其中19株為Carba NP試驗陽性，11株為Carba NP試驗陰性。

2.2耐藥基因檢測結(jié)果 19株Carba NP確證實驗陽性的肺炎克雷伯菌中18株為KPC-2陽性，1株為NDM-1陽性；ESBLs和AmpC酶的攜帶率為：blaCTX-M 63.2%(12/19)，blaSHV 15.8%(3/19)blaTEM 47.4%(9/19)；無AmpC酶的檢出。Carba NP試驗陰性的肺炎克雷伯菌未檢測到碳青霉烯酶基因，ESBLs和AmpC酶的攜帶率為：blaCTX-M 72.7%(8/11)，blaSHV 27.3%(3/11)，blaDHA 27.3%(3/11),blaTEM 72.7%(8/11)。未檢測到其他ESBLs基因。見表1。

2.3外膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果 不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌外膜蛋白經(jīng) SDS-PAGE 檢測表明：編號2368、2875、3050的菌株OmpK36缺失，其他菌株未見外膜蛋白缺失。見表2。

2.4CCCP抑制試驗結(jié)果 加入CCCP時11株不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南和厄他培南的最小抑菌濃度值與CCCP不存在時的MIC值有明顯變化，均降低4倍及以上。

表1 19株產(chǎn)碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌

注：ICU為重癥監(jiān)護室

表2 11株不產(chǎn)碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌

注：-為無數(shù)據(jù)；ICU為重癥監(jiān)護室

3 討 論

CRKP的出現(xiàn)及播散，對醫(yī)院的患者及醫(yī)護人員的生命安全造成了極大的威脅，可用于治療此類細菌感染的藥物非常有限。明確此類細菌的耐藥機制，對于及時有效地采取控制措施有很大的指導(dǎo)作用。目前研究發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶的產(chǎn)生，尤其是KPC-2的產(chǎn)生是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因[4-5]；其次為ESBLs或AmpC基因過度表達合并外膜孔蛋白的丟失；外排泵的高表達導(dǎo)致的耐藥在肺炎克雷伯菌中極少見，主要見于非發(fā)酵菌[6-8]。

本研究證實碳青霉烯酶的產(chǎn)生，尤其是KPC酶的產(chǎn)生是本院肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。進一步探究11株不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌具體耐藥機制發(fā)現(xiàn)：對不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌進行ESBLs檢測時，72.7%(8/11)的菌株檢測到TEM-1，其屬于廣譜內(nèi)酰胺酶，而非ESBLs。CCCP抑制試驗顯示CCCP的存在使得11株菌株的MIC降低4倍及以上，因此推斷這11株菌中可能存在針對碳青霉烯類抗菌藥物的外排泵從而導(dǎo)致菌株耐藥。

LEE等[9]研究發(fā)現(xiàn)對于產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌只缺失一種膜孔蛋白不會引起碳青霉烯耐藥，而產(chǎn)AmpC酶的肺炎克雷伯菌缺失一種或者兩種膜孔蛋白均可導(dǎo)致碳青霉烯耐藥或者中介。編號2368、2875、3050的菌株SDS-PAGE結(jié)果顯示OmpK36缺失，且同時表達AmpC酶，提示這3株菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥是由AmpC酶過度表達合并外膜孔蛋白OmpK36的丟失，以及外排泵高表達共同作用導(dǎo)致的。其余8株不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的耐藥機制主要為外排泵的高表達所致。

綜上所述，碳青霉烯酶尤其是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的產(chǎn)生是本院肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因，其次為外排泵高表達。同時也發(fā)現(xiàn)，2014年分離CRKP菌株中存在多種耐藥機制的協(xié)同作用：高產(chǎn)AmpC酶，外排泵高表達，外膜蛋白缺失。

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