李笑冰 岳宗源 白婧 任壘 饒維 彭程 費(fèi)舟 張磊*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅，陜西 西安 710032; 291709部隊(duì)衛(wèi)生所，吉林 琿春 133300; 3空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032; 4解放軍第261醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100094)

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，一種炎性分子—核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3, NLRP3)與被溶酶體蛋白酶激活的Caspase1結(jié)合，形成NLRP3炎性小體后，會(huì)促進(jìn)白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的分泌，加重機(jī)體損傷[1]。而一種糖蛋白-烏司他丁(ulinastatin, UTI)具有強(qiáng)大的廣譜溶酶體酶抑制功能，其預(yù)處理對(duì)急性外傷性胰腺炎、肺損傷、休克和創(chuàng)傷性腦損傷等各組織器官危重傷病具有明顯的保護(hù)作用[2]。雖然，大量研究表明炎性反應(yīng)是缺血再灌注腦損傷的重要病理機(jī)制之一，但具體分子病理機(jī)制尚不清楚，缺乏有效的治療手段，所以探索其具體分子機(jī)制，研究新型抗缺血藥物成為目前研究熱點(diǎn)。本研究擬探討UTI預(yù)處理措施是否可以通過下調(diào)NLRP3的表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)的作用，為UTI治療缺血性腦損傷提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

健康C57孕鼠，孕15～16 d，清潔級(jí)，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔抗大鼠NLRP3單克隆抗體由AdipoGen提供；兔抗大鼠β-Actin單克隆抗體由Cell Signaling提供；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記由中杉金橋提供；CCK-8試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。

二、方法

1.神經(jīng)元培養(yǎng)：孕齡14～15 d的C57孕鼠頸椎處死取胎鼠，體視顯微鏡下分離出大腦皮層，0.125%的胰蛋白酶消化15 min，用含20%的胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，制備細(xì)胞懸液，均勻接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度約為8×105/mL，最后將培養(yǎng)板置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal)，以后每3 d進(jìn)行半量換液。

2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元缺血再灌注損傷的制作、UTI預(yù)處理及分組：培養(yǎng)原代神經(jīng)元至成熟，選取3 h、6 h兩個(gè)氧糖剝奪時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)將細(xì)胞分為3 h、6 h組，分別在兩組內(nèi)隨機(jī)分為空白組(Sham組)、對(duì)照組(Control組)和烏司他丁預(yù)處理組(UTI組)，將神經(jīng)元培養(yǎng)液換成無糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)，并放置于37 ℃，含氮?dú)饧癈O2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)3 h、6 h后，取出神經(jīng)元，再次更換高糖DMEM含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)培養(yǎng)基，并放置置于37 ℃、50 mL/CO2孵箱中培養(yǎng)2 h后提取細(xì)胞[3]。UTI組在第6～8天維持培養(yǎng)基UTI 100 U/mL、UTI 1 000 U/mL，對(duì)照組在第6天給予等劑量生理鹽水，空白組細(xì)胞造模前不做任何處理。

3.免疫熒光檢測(cè)NLRP3空間表達(dá)：神經(jīng)元經(jīng)4%多聚甲醛固定后，驢血清封閉30 min，加入一抗抗體(NLRP3 1 ∶50)4 ℃過夜，PBS洗滌3遍，加入驢抗兔熒光二抗抗體(1 ∶1 000)室溫孵育3 h，PBS洗滌5遍，Hoechst 染料染核5 min，PBS洗滌5遍，鏡檢。

4.Western blot 檢測(cè)NLRP3蛋白水平變化：收集各組處理過的神經(jīng)元，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與NLRP3(1 ∶500)，β-actin(1 ∶2 000)抗體結(jié)合，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，電化發(fā)光法顯色后照相。最后用凝膠成像系統(tǒng)(image master VDS)攝影，圖像分析軟件(Image J) 行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin 的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對(duì)量。并進(jìn)行掃描圖像分析儀計(jì)算蛋白條帶的表達(dá)。

5.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性：將原代神經(jīng)元接種于96孔板中，同體外培養(yǎng)神經(jīng)元缺血再灌注損傷的制作、UTI預(yù)處理及分組，加入CCK-8溶液后孵育1～4 h后測(cè)定吸光度。

結(jié) 果

一、熒光免疫組化檢測(cè)神經(jīng)元NLRP3表達(dá)的結(jié)果

與Sham組比較，氧糖剝奪3 h和6 h后Control組神經(jīng)元大量死亡，但存活神經(jīng)元中NLRP3的染色陽性率高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但3 h和6 h Control組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與氧糖剝奪3 h和6 h Control組比較，UTI 100和1000組有較多神經(jīng)元存活，且NLRP3染色陽性率較高，UTI和1000組之間免疫組化結(jié)果比較無顯著差異(P>0.05)。同時(shí)，NLRP3染色陽性率有NLRP3熒光免疫組化染色結(jié)果提示，陽性染色呈顆粒狀，分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和突起上(圖1)。

二、Western blot檢測(cè)UTI預(yù)處理后神經(jīng)元NLRP3表達(dá)的結(jié)果

與氧糖剝奪3 h后Control組比較，Sham組和UTI 100組NLRP3的表達(dá)降低不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而UTI 1000組NLRP3表達(dá)顯著降低(P<0.05)，提示UTI不僅能降低NLRP3表達(dá)，而且具有劑量依賴性；而與氧糖剝奪6 h后Control組比較，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示UTI 100和1000組NLRP3表達(dá)均顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；同時(shí)，UTI 100和1000組之間比較也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖2)。

三、CCK-8試劑盒檢測(cè)UTI預(yù)處理后神經(jīng)元凋亡的結(jié)果

與Control組比較，氧糖剝奪3 h Sham組(0.358±0.015)和UTI 100(0.377±0.010)以及1000組(0.371±0.013)細(xì)胞活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而氧糖剝奪6 h組中UTI 100(0.307±0.012)和1000組神經(jīng)元凋亡水平均顯著下降(P<0.05)，其中以UTI 6 h 1000組下降最為明顯，其OD值為0.459±0.039(P<0.01)。

圖1 四組原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元NOD樣受體蛋白3(NLRP3)免疫組織化學(xué)圖像(免疫熒光染色, ×400)

Fig 1 NLRP3 protein of neurons in four groups by immunohistochemistry (Immunofluorescent staining, ×400)

A: OGD for 6 h; B: OGD for 6 h with saline; C: OGD 6 h with UTI, 100 U/mL; D: OGD 6 h with UTI, 1 000 U/mL.

The nuclear was marked by blue-fluorescence, while NLRP3 was marked by green-fluorescence.

圖2 Western blot 檢測(cè)NLRP3蛋白在各組中的表達(dá)變化

Fig 2 NLRP3 expression in the neurons of each group detected byWestern blot

A: NLRP3 expression in the neurons of each group filmed by Image master VDS; B: Detection of NLRP3 expression analyzed by Image J. OGD 3 h stands for oxygen-glucose deprivation for 3 h, and the S behind OGD 3 h stands for sham, C stands for control, the number stands for the concentration of UTI. And the following options are in the same way.

aP﹤0.01,bP﹤0.05,vsOGD 6 h C;cP﹤0.05,dP>0.05,vsOGD 3 h C.

討 論

近年來，作為一種從健康男性尿液中提取精制而成的糖蛋白，UTI通過抑制多種活性亢進(jìn)的蛋白酶及其釋放，穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜；抑制炎癥介質(zhì)釋放和消除氧自由基；抑制心肌抑制因子產(chǎn)生和并高度對(duì)抗機(jī)體無損害的酶活性，控制過度的炎癥反應(yīng)，減輕機(jī)體損傷，促進(jìn)機(jī)體康復(fù)。大量研究表明，UTI對(duì)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-8(interleukin-8, IL-8)等炎癥介質(zhì)有顯著抑制作用，在肺挫傷后早期應(yīng)用效果顯著。有人研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后可能有多種繼發(fā)性物質(zhì)釋放，誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集活化，釋放多種炎癥物質(zhì)，如彈性蛋白酶、氧自由基等，直接作用肺血管，影響通透性，導(dǎo)致神經(jīng)源性肺水腫，應(yīng)用UTI能改善和抑制上述情況的發(fā)生[4-5]。Yamaguchi等[6]研究提示UTI在潰瘍性結(jié)腸炎模型中抑制炎性因子的釋放。孫來芳等[7]在以往研究中提示UTI可能在膿毒癥大鼠模型上抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)，提高白介素-10(interleukin-10, IL-10)和白介素-13(interleukin-13, IL-13)的表達(dá)水平來起到保護(hù)作用。最近的研究還揭示長(zhǎng)時(shí)期或者短時(shí)期使用UTI可阻止慢性胰腺炎模型造成的熱痛過敏。He等[8]又發(fā)現(xiàn)UTI預(yù)處理可以改善大鼠心肺復(fù)蘇后的心肌損傷，其可能的保護(hù)機(jī)制為調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、免疫反應(yīng)和其他相關(guān)基因的表達(dá)。多篇?jiǎng)?chuàng)傷性腦損傷研究中發(fā)現(xiàn)[9-11]，UTI等通過抑制組織蛋白酶B(Cathepsin B)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)等表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和死亡，發(fā)揮重要的腦保護(hù)作用。本文研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，不同劑量的UTI都可能減少缺血性腦損傷后神經(jīng)元凋亡，特別是大劑量UTI腦保護(hù)作用更強(qiáng)，具有明顯的劑量依賴性。

大量文獻(xiàn)提示，炎性反應(yīng)是缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理過程之一。各種炎性分子，特別是近年來新發(fā)現(xiàn)的NLRP3在其中發(fā)揮重要的分子調(diào)控作用。Mankan等[12]研究證實(shí)，在細(xì)胞的損傷和壞死過程中都可能存在溶酶體的損傷，釋放大量的組織蛋白酶，激活NLRP3 因子與已被激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase1)結(jié)合，形成NLRP3炎性小體，促進(jìn)IL-1β、IL-6和白介素-18(interleukin-18, IL-18)等的產(chǎn)生，影響細(xì)胞存活，給機(jī)體造成傷害。因此，NLRP3可能會(huì)識(shí)別導(dǎo)致溶酶體損傷及組織蛋白酶B活化的危險(xiǎn)因子，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)UTI可以顯著降低NLRP3的表達(dá)水平，減輕炎性反應(yīng)，保護(hù)受損神經(jīng)元。結(jié)合文獻(xiàn)，這些結(jié)果提示，在缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展過程中，神經(jīng)元溶酶體大量破壞，釋放大量水解酶，激活炎性反應(yīng)。而在此過程中，利用UTI穩(wěn)定溶酶體膜，減少水解酶和炎性因子，特別是NLRP3的釋放和表達(dá)，打斷炎性反應(yīng)通路，可以減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮保護(hù)受損神經(jīng)元的作用。但其保護(hù)作用對(duì)濃度要求較高，其發(fā)揮最大保護(hù)作用的最佳濃度及臨床實(shí)用性有待進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于NLRP3在腦損傷發(fā)病機(jī)制的的研究已經(jīng)取得了極大的進(jìn)展，但還不夠透徹，而且，是否能夠以NLRP3為藥物靶點(diǎn)，進(jìn)行缺血性腦損傷藥物研究，還需我們提供更多的實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)和理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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