呂萌，沈萃萃

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510405)

銀屑病是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與遺傳、內(nèi)分泌、免疫功能異常及微循環(huán)障礙等有關(guān)[1，2]。濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)是近年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群[3,4]，已被證實(shí)可參與自身免疫性疾病的發(fā)生。Tfh主要以膜表面表達(dá)CXC趨化因子受體5(CXCR5)以及誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)表達(dá)等為特征[5]。CXCR5是Tfh區(qū)別于其他CD4+T細(xì)胞的標(biāo)志，ICOS表達(dá)在活化Tfh細(xì)胞中。Tfh可分泌IL-21[6]，但血清IL-21并不全是由Tfh分泌，輔助性T細(xì)胞17(Th17)也能分泌IL-21。本研究觀察了銀屑病患者外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平變化，并探討其在銀屑病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年10月～2017年2月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的銀屑病患者77例(觀察組)，男44例、女33例，年齡33～62(44.2±5.3)歲，銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度評(píng)分(PASI評(píng)分)[7](總分72分，得分越高，病情越重)≥10分42例、<10分35例。所有患者符合趙辯主編《臨床皮膚病學(xué)》[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病以及其他慢性疾病者，入院前30天內(nèi)接受過可能會(huì)影響免疫功能的藥物治療者，合并惡性腫瘤者。另選同期在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受體檢的健康者70例(對(duì)照組)，男41例、女29例，年齡32～63(44.4±5.5)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 外周血Tfh(CD4+CXCR5+T細(xì)胞)、活化Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞)及Th17比例檢測(cè) 所有研究對(duì)象(觀察組入院次日)采集清晨空腹靜脈血6 mL，均分為2份，取任意一份EDTA抗凝，與等體積的PBS混勻，加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞；將單個(gè)核細(xì)胞保存在含有10%胎牛血清的二甲基亞砜培養(yǎng)液中。用PBS重懸上述細(xì)胞，分別加入CD45-PC7、CD3-ECD、CD4-FITC、CXCR5-PC以及ICOS-PE抗體各20 μL，充分震蕩后置于陰暗處孵育20 min。滴加PBS 2 mL，離心后去除上清液，重復(fù)洗滌2次；滴加PBS 500 μL重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CXCR5+T細(xì)胞、CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞。采用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整上述單個(gè)核細(xì)胞密度為8.0×105個(gè)/mL，隨后將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，加入50 ng/mL的佛波酯、500 ng/mL離子霉素、1 mmol/L布雷非德菌素A，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入CD45-PC7、CD3-ECD、CD8-PE各20 μL，室溫避光條件下孵育20 min，PBS重復(fù)洗滌2次，離心處理去除上清液；固定劑固定15 min，PBS洗滌1次，離心處理去除上清液；加入破膜劑在室溫下孵育5 min，離心處理去除上清液；加入IL-17抗體，室溫避光條件下孵育20 min，離心處理去除上清液；加入PBS 500 μL重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17。

1.3 血清IL-21檢測(cè) 取另一份空腹靜脈血標(biāo)本，分離血清后采用ELISA法檢測(cè)血清IL-21。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比較 觀察組外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 觀察組PASI評(píng)分≥10分者與<10分者外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比較 觀察組PASI評(píng)分≥10分者外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平均高于PASI評(píng)分<10分者(P均<0.05)，但二者外周血Tfh、Th17比例比較P均>0.05。見表2。

表2 觀察組PASI評(píng)分≥10分者與<10分者外周血Tfh、 活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比較

注：與PASI評(píng)分<10分者比較，*P<0.05。

3 討論

研究認(rèn)為，免疫功能異常可參與銀屑病發(fā)生、發(fā)展[9,10]。Tfh是一種功能強(qiáng)大的T細(xì)胞亞群，是CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的一個(gè)亞群，因其表達(dá)CXCR5和IL-21等，故可存在于淋巴濾泡中并輔助B細(xì)胞活化和分化。IL-21為Tfh分泌的主要細(xì)胞因子，也是其最主要的效應(yīng)執(zhí)行分子。目前主要通過檢測(cè)T細(xì)胞表面CXCR5和ICOS蛋白的方法來確定Tfh。外周血Tfh比例在多種自身免疫性疾病患者(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)中升高，故筆者推測(cè)Tfh細(xì)胞可能參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道，自身免疫性疾病患者外周血Tfh比例明顯升高，且其升高程度和致病性抗體水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示外周血Tfh可參與自身免疫性疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血Tfh、活化Tfh比例均明顯高于對(duì)照組。表明外周血Tfh在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用。薛國(guó)輝等[11，12]報(bào)道，銀屑病患者外周血Tfh比例升高，本研究結(jié)果與之相符。表明外周血Tfh在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。觀察組外周血Th17比例明顯高于對(duì)照組，表明Th17細(xì)胞也可能參與了銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程，與文獻(xiàn)[13～16]報(bào)道相符。觀察組血清IL-21水平明顯高于對(duì)照組，表明IL-21作為Thf的效應(yīng)分子參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，觀察組PASI評(píng)分≥10分者外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平均明顯高于PASI評(píng)分<10分者，表明檢測(cè)外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平有助于患者病情判斷。Tfh細(xì)胞可自分泌或旁分泌IL-21，Th17也可分泌IL-21。綜合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為觀察組血清IL-21水平高于對(duì)照組是由于活化Tfh比例升高而不是由于Th17分泌增多所致。表達(dá)ICOS的活化Tfh可能是在銀屑病發(fā)病過程中起致病作用的主要效應(yīng)細(xì)胞，其可嚴(yán)重影響Tfh的存活狀態(tài)，同時(shí)對(duì)Tfh分泌IL-21的能力進(jìn)行調(diào)控。因此認(rèn)為，活化Tfh可能是通過調(diào)控IL-21的分泌而參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。活化Tfh可調(diào)控IL-21的分泌，影響外周血IL-21水平，繼而影響炎癥反應(yīng)過程，導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，檢測(cè)外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平有助于輔助評(píng)估銀屑病患者病情。

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