宋蒨，石紅建，任景麗，黃優(yōu)華，徐強(qiáng)，孫鐘武，張中平

(1 江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院，江蘇常州213002；2 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，約95%結(jié)直腸癌為散發(fā)性結(jié)直腸癌(SCC)[1,2]，而15% SCC是由錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)蛋白表達(dá)缺失引起的[3]。目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MMR有9種，即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6，其作用主要是識(shí)別錯(cuò)配位點(diǎn)并予以糾正，以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。如MMR發(fā)生突變，將引起機(jī)體錯(cuò)配修復(fù)功能缺失，導(dǎo)致整個(gè)基因組不穩(wěn)定，從而使某些癌基因或突變的抑癌基因快速聚集，繼而形成腫瘤[4]。在MMR中，hMLH1、hMSH2、hMSH6突變約占MMR突變的90%以上[5，6]。本研究觀察了SCC組織MMR蛋白表達(dá)變化，現(xiàn)分析其表達(dá)變化與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 基本資料 研究對象為2009年6月～2012年6月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院行手術(shù)治療的SCC患者180例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷?；颊吣?8例、女82例，年齡60～86(70.89±8.13)歲；腫瘤直徑：≥5 cm 76例，<5 cm 104例；腫瘤形態(tài)：潰瘍型95例，隆起型47例，浸潤型38例；腫瘤部位：右半結(jié)腸106例，左半結(jié)腸或直腸74例；病理類型：腺癌136例，黏液腺癌或其他類型44例；TNM分期[7]：Ⅱ期86例，Ⅲ期94例；組織分化程度：高分化68例，中低分化112例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移94例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例。術(shù)后每3個(gè)月隨訪1次，隨訪方式包括門診及住院復(fù)查、電話隨訪等。隨訪截至2017年6月，中位隨訪時(shí)間60個(gè)月，死亡68例。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 SCC組織hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的SCC組織，采用免疫組化法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)。以正常結(jié)直腸黏膜上皮作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷：MMR蛋白定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例綜合判斷MMR蛋白表達(dá)。染色強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例：無陽性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，>10%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積>3分為MMR蛋白表達(dá)正常，≤3分為MMR蛋白表達(dá)缺失。hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白均正常表達(dá)為正常表達(dá)(pMMR)，至少一項(xiàng)蛋白表達(dá)缺失即為陰性表達(dá)(dMMR)。本組MMR蛋白表達(dá)缺失29例，表達(dá)缺失率為16.1%。其中hMLH1蛋白表達(dá)缺失19例，hMSH2蛋白表達(dá)缺失13例，hMSH6蛋白表達(dá)缺失10例；僅hMLH1蛋白表達(dá)缺失11例，僅hMSH2蛋白表達(dá)缺失4例，僅hMSH6蛋白表達(dá)缺失3例，hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)均缺失4例，hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)均缺失3例，hMLH1、hMSH6蛋白表達(dá)均缺失2例，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)均缺失2例。本組pMMR 29例，dMMR151例。

1.4 SCC組織MMR蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 SCC組織MMR蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

1.5 不同MMR表達(dá)者5年無病生存率及5年總生存率比較 采用Kaplan-Meier法繪制生存時(shí)間曲線，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，dMMR者與pMMR者5年無病生存率分別為75.9%(22/29)、43.7%(66/151)，5年總生存率分別為82.8%(24/29)、58.3%(88/151)，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為10.872、6.044，P均<0.01)。見圖1、2。

2 討論

1993年Lothe等[8]發(fā)現(xiàn)了一條新的可導(dǎo)致SCC途徑——MMR途徑。MMR蛋白的主要功能是保證基因復(fù)制的精確性，在DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配時(shí)，MMR識(shí)別并予以修復(fù)，以保證基因組穩(wěn)定性。如MMR發(fā)生突變，將引起錯(cuò)配修復(fù)功能缺失，導(dǎo)致整個(gè)基因組不穩(wěn)定，從而使某些癌基因或突變的抑癌基因快速聚集，繼而形成腫瘤[4]。

圖1 不同MMR表達(dá)SCC患者無病生存時(shí)間曲線

圖2 不同MMR表達(dá)SCC患者總生存時(shí)間曲線

目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了9種MMR蛋白，任意一個(gè)MMR蛋白表達(dá)缺失，均會(huì)導(dǎo)致MMR系統(tǒng)功能缺失。在MMR突變中，hMLH1、hMSH2、hMSH6突變超過90%。hMLH1、hMSH2、hMSH6多形成異源二聚體發(fā)揮作用，可特異性識(shí)別核苷酸鏈上的錯(cuò)配位點(diǎn)，并進(jìn)行切除、修復(fù)。hMLH1蛋白在錯(cuò)配修復(fù)過程中主要參與核酸內(nèi)切酶激活，在切開堿基及解除雙螺旋過程中發(fā)揮重要作用，并參與合成新的核苷酸鏈；還可與hPMS1形成Mutlα，糾正錯(cuò)誤插入的堿基。hMSH2是最早發(fā)現(xiàn)的MMR蛋白，其表達(dá)于所有正常結(jié)直腸黏膜，通過與hMLH1蛋白結(jié)合形成異源二聚體hMutLα，hMutLα識(shí)別并結(jié)合錯(cuò)配修復(fù)的堿基，繼而激活核酸內(nèi)切酶，切除錯(cuò)配的堿基。hMSH6具有ATP酶活性，在錯(cuò)配修復(fù)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還可與hMSH2蛋白形成二聚體，接受ATP供能，與相應(yīng)的錯(cuò)配堿基結(jié)合并將其游離。在DNA復(fù)制過程發(fā)生堿基錯(cuò)配后，MMR系統(tǒng)啟動(dòng)修復(fù)。修復(fù)過程包括錯(cuò)配堿基識(shí)別、MMR蛋白聚集、錯(cuò)配堿基修復(fù)。相應(yīng)的MMR蛋白在形成異二聚體后，切除包含錯(cuò)配堿基的DNA片段，然后補(bǔ)充新合成的正確DNA片段，以確?；蛐畔?zhǔn)確。當(dāng)MMR基因發(fā)生突變或修飾后，MMR蛋白表達(dá)缺失，繼而MMR功能缺失，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[9]。MMR蛋白低表達(dá)可降低基因錯(cuò)配修復(fù)功能，增加腫瘤發(fā)生的易感性。其引起腫瘤發(fā)生的機(jī)制：①M(fèi)MR功能缺失可引起基因組變化，造成簡單重復(fù)序列的累積，發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定，而微衛(wèi)星不穩(wěn)定可造成某些癌基因的激活，進(jìn)一步誘發(fā)腫瘤[10]；②MMR系統(tǒng)缺陷會(huì)直接造成某些原癌基因和抑癌基因突變，如無法及時(shí)糾正，將導(dǎo)致癌基因異常表達(dá)、累積，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，SCC組織MMR蛋白表達(dá)缺失率達(dá)16.1%，與Ghanipour等[11]研究結(jié)果基本一致。既往研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達(dá)缺失與腫瘤某些臨床病理特征有關(guān)[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達(dá)缺失與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與既往研究[14，15]結(jié)果基本一致。有研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達(dá)變化與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)[14，16]；以5-Fu為基礎(chǔ)的化療可延長結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間，提高患者5年生存率[17]。但也有研究認(rèn)為，dMMR者無法從以5-Fu為基礎(chǔ)的化療方案中獲益，對TNM分期為Ⅱ期的dMMR者甚至有害[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，dMMR者5年無病生存率及總生存率均高于pMMR者。提示dMMR者預(yù)后相對較好，可能與MMR可增強(qiáng)患者免疫監(jiān)視功能有關(guān)[19]，也可能與腫瘤組織胸苷合成酶和二氫嘧啶脫氫酶過表達(dá)有關(guān)[13]。

綜上所述，SCC組織可出現(xiàn)MMR蛋白表達(dá)缺失，其表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后有關(guān)。

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