張亞美 孫悅鑫 陶玥 包軍

210008南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚性病科

惡性黑素瘤是惡性程度高、侵襲性強的皮膚腫瘤［1?2］。近年來新興的靶向藥物，如抗程序性細(xì)胞死亡1受體及其配體單抗、抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4單抗、BRAF基因突變抑制劑等均顯示了較好的療效，但不能有效控制復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，容易出現(xiàn)耐藥性，且性價比低，因此尋求有效、經(jīng)濟(jì)的新型抗黑素瘤藥物十分必要［3］。隨著對細(xì)胞凋亡機(jī)制的闡明，以特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的分子靶向藥物逐漸引起關(guān)注。我們的前期［4］研究證實，雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide）可誘導(dǎo)人黑素瘤A375細(xì)胞凋亡。已有研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇可通過多條信號通路誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中CHOP（C/EBP同源蛋白）表達(dá)顯著增加是引起細(xì)胞凋亡的啟動因素［5］。本研究旨在探討CHOP依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路在雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)黑素瘤A375細(xì)胞凋亡中的作用。

材料與方法

一、材料

雷公藤內(nèi)酯醇產(chǎn)自美國Selleck公司；人惡性黑素瘤A375細(xì)胞產(chǎn)自美國ATCC細(xì)胞庫；高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶、雙抗產(chǎn)自美國Gibco公司；CCK8試劑盒產(chǎn)自日本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒產(chǎn)自美國BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）引物、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）引物、CHOP引物產(chǎn)自日本Takara公司；GRP78抗體產(chǎn)自美國CST公司；PERK、p?PERK抗體、CHOP抗體、β肌動蛋白抗體產(chǎn)自英國Abcam公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制：將A375細(xì)胞接種于含有1%青鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于各項實驗。將雷公藤內(nèi)酯醇溶解于二甲基亞砜（DMSO），使其終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L；DMSO在培養(yǎng)基中的最大終濃度＜0.1%，經(jīng)預(yù)實驗證實對細(xì)胞增殖無影響。

2.光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：取對數(shù)生長期A375細(xì)胞按每孔1×106接種于6孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h，加入不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇（12.5、25、50、100、200 nmol/L），陰性對照組不加雷公藤內(nèi)酯醇，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在光鏡下觀察、拍照。

3.CCK8檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期A375細(xì)胞按每孔5×103接種于96孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h，加入不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇（12.5、25、50、100、200 nmol/L），每一濃度設(shè)3個復(fù)孔；陰性對照組不加雷公藤內(nèi)酯醇；空白組無細(xì)胞只加培養(yǎng)基。各組細(xì)胞分別孵育24、48、72 h后加入CCK8試劑孵育2 h；用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔A值，細(xì)胞增殖抑制率＝［1-（待測物各濃度A值－空白組平均A值）/（陰性對照組A值－空白組A值）］×100%。

4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期A375按1×106/孔接種于6孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h；去上清液，加入不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇，陰性對照組不加雷公藤內(nèi)酯醇，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化、收集細(xì)胞，移至流式管，PBS洗滌2次，1×結(jié)合緩沖液洗滌1次，100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl膜聯(lián)蛋白V混勻后，加入5 μl碘化丙錠，混勻，室溫下避光孵育15 min；每管加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，混勻，送流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

5.透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)：將A375細(xì)胞接種于6孔板，加入200 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇處理24 h后，消化收集細(xì)胞，戊二醛和鋨酸先后固定，脫水，包埋，固化，切片，采用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色法，透射電鏡觀察、拍照。

6.Western印跡檢測 GRP78、p?PERK、PERK、CHOP蛋白水平：用不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇預(yù)處理A375細(xì)胞，同時設(shè)置陰性對照組（無雷公藤內(nèi)酯醇），24 h后提取蛋白，測定蛋白濃度，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉，加一抗（PERK和p?PERK抗體、CHOP抗體、β肌動蛋白抗體）4℃孵育過夜后，加二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測反應(yīng)條帶。應(yīng)用BandScan 4.5圖像分析軟件分析，以β肌動蛋白灰度值為內(nèi)參照，計算PERK、p?PERK、CHOP的相對表達(dá)水平。

另取部分A375細(xì)胞，用不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇分別預(yù)處理24、48、72 h，同時設(shè)置陰性對照組，按上述方法提取蛋白并作相應(yīng)處理后，加一抗（GRP78抗體、β肌動蛋白抗體）4℃孵育過夜，加二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測反應(yīng)條帶。對圖像進(jìn)行分析，應(yīng)用BandScan 4.5圖像分析軟件，以β肌動蛋白的表達(dá)灰度值為內(nèi)參照，計算GRP78相對表達(dá)水平。

7.qPCR檢測GRP78、PERK及CHOP mRNA水平：檢索基因庫，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計正、反向引物。GRP78：正向引物5′?ATTTCACAGCCAGCCTTC TTACT?3′，反向引物 5′?CATTTTGTCCTTCTCTGCTT CAG?3′；PERK：正向引物5′?CTCACAGGCAAAGGA AGGAG?3′，反向引物 5′?AACAACTCCAAAGCCAC CAC?3′；CHOP：正向引物5′?CACCTATATCTCATCC CCAGGA?3′，反向引物5′?ACCACTCTGTTTCCGTTT CCTA?3′；β肌動蛋白：正向引物5′?GTTTGAGACCT TCAACACCCC?3′，反向引物5′?GTGGCCATCTCTCT TGCTCGAAGTC?3′。用不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h，陰性對照組不用雷公藤內(nèi)酯醇處理。提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μl，分別為SYBR Mix 5 μl、正反向引物各 0.4 μl，ROX 0.2 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 3 μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)各個基因的閾值循環(huán)數(shù)（Ct），利用β肌動蛋白校正，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）陰性對照組，計算GRP78、PERK、CHOP基因的相對表達(dá)水平（2?△△C）t。

三、統(tǒng)計分析

用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示。不同濃度組間觀察指標(biāo)的變化采用單因素方差分析，不同時間和濃度組間比較采用可重復(fù)的雙因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、雷公藤內(nèi)酯醇對A375形態(tài)的影響

光鏡下觀察，陰性對照組A375細(xì)胞形態(tài)無變化，貼壁生長，呈長梭形或多角形，細(xì)胞生長密集，細(xì)胞形態(tài)一致。雷公藤內(nèi)酯醇作用24 h后，隨著濃度增高，細(xì)胞數(shù)漸減少，形態(tài)變?yōu)榧?xì)長梭形，胞質(zhì)變少，細(xì)胞大小不一，形狀不規(guī)則，出現(xiàn)較多突起，見圖1。

二、雷公藤內(nèi)酯醇對A375增殖抑制率的影響

見圖2。雙因素方差分析顯示，雷公藤內(nèi)酯醇對A375增殖的抑制呈濃度（F濃度=34.898，P＜0.05）和時間（F時間=3.191，P＜0.05）依賴性。兩兩多重比較顯示，12.5、25、50、100、200 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇作用24、48、72 h后，A375增殖抑制率均顯著高于各自的陰性對照組（增殖抑制率為0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。相同作用濃度下，雷公藤內(nèi)酯醇作用不同時間，除12.5 nmol/L濃度組作用24 h與48 h和100 nmol/L濃度組作用48 h和72 h外，各組與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。雷公藤內(nèi)酯醇處理A375細(xì)胞24、48、72 h時半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為308、83、55 nmol/L。

三、雷公藤內(nèi)酯醇對A375凋亡的影響

12.5、25、50、100、200 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇作用24 h后，細(xì)胞凋亡率由陰性對照組的3.3%±0.4%分別上升至10.3%±0.1%、14.6%±0.8%、17.4%±0.7%、21.1% ±1.0%、29.5% ±1.1%（F=429.921，P＜0.01，圖3）。隨藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，各濃度雷公藤內(nèi)酯醇組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各濃度組間比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)變化（×100） 雷公藤內(nèi)酯醇作用后，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，變?yōu)榧?xì)長梭形并出現(xiàn)較多突起，大小不一，且隨藥物濃度的增加更加明顯

四、雷公藤內(nèi)酯醇對A375細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的影響

由圖4可見，正常A375細(xì)胞腔內(nèi)可見較多粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，排列整齊，呈扁平囊狀，200 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)腫脹、不規(guī)則擴(kuò)張、斷裂以及扭曲。

五、雷公藤內(nèi)酯醇對A375細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用24、48、72 h后A375細(xì)胞增殖抑制率

圖3 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后凋亡率Q2和Q4區(qū)間代表細(xì)胞凋亡率

1.對p?PERK、PERK及CHOP蛋白表達(dá)的影響：12.5、25、50、100、200 nmol/L 雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后，p?PERK、PERK及CHOP蛋白表達(dá)水平隨雷公藤內(nèi)酯醇濃度升高均逐漸增加，且各雷公藤內(nèi)酯醇組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。除50、100、200 nmol/L組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他濃度組間p?PERK、CHOP表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而PERK蛋白水平除在12.5 nmol/L與25 nmol/L組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、表1。

圖4 雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化4A：陰性對照組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，呈扁平囊狀結(jié)構(gòu)；4B：200 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)腫脹、不規(guī)則擴(kuò)張、斷裂以及扭曲

圖5 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后p?PERK、PERK、CHOP蛋白表達(dá)水平 PERK：蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；p?PERK：磷酸化PERK；CHOP：C/EBP同源蛋白

表1 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞后p?PERK、PERK、CHOP、GRP78蛋白表達(dá)（±s，n=3）

表1 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞后p?PERK、PERK、CHOP、GRP78蛋白表達(dá)（±s，n=3）

注：a與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；b與上一濃度組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PERK：蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；p?PERK：磷酸化PERK；CHOP：C/EBP同源蛋白；GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

雷公藤內(nèi)酯醇濃度0（對照組）12.5 nmol/L 25.0 nmol/L 50.0 nmol/L 100.0 nmol/L 200.0 nmol/L F值P值p?PERK PERK CHOP GRP78 1 1 1 3.288±0.231a 5.910±0.216a b 6.977±0.154a b 7.287±0.194a 7.451±0.231a 574.254＜0.05 3.894±0.114a 4.009±0.140a 4.621±0.384a b 5.974±0.224a b 7.925±0.378a b 257.788＜0.05 1.451±0.093a 2.592±0.239a b 3.867±0.208a b 3.957±0.147a 4.037±0.127a 223.769＜0.05 24 h 1 2.326±0.173a 3.197±0.202a b 3.292±0.252a 3.320±0.225a 3.588±0.153a 82.359＜0.05 48 h 1 1.488±0.144a 1.577±0.083a 2.320±0.271a b 2.447±0.264a 2.395±0.196a 30.926＜0.05 72 h 1 1.379±0.320 1.375±0.333 1.641±0.119a 2.130±0.121a 2.572±0.262a 19.039＜0.05

2.對A375細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)的影響：見圖6、表1。與陰性對照組比較，12.5、25、50、100、200 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇作用細(xì)胞不同時間（24、48、72 h）后，GRP78蛋白水平均隨藥物濃度增加逐漸升高；隨著藥物作用時間延長，各濃度組（200 nmol/L組除外）細(xì)胞的GRP78蛋白水平均呈逐漸下降趨勢。雙因素方差分析顯示，不同濃度及不同作用時間下，GRP78蛋白表達(dá)量不同（F時間=15.888，F(xiàn)濃度=10.540，均P＜ 0.05）；兩兩多重比較顯示，除12.5 nmol/L與25 nmol/L雷公藤內(nèi)酯醇作用72 h外，各雷公藤內(nèi)酯醇組與陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；各濃度組作用48、72 h分別與24 h比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用24、48、72 h對A375細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)的影響

表2 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用24 h后A375細(xì)胞GRP78、PERK、CHOP mRNA相對表達(dá)量（±s）

表2 不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用24 h后A375細(xì)胞GRP78、PERK、CHOP mRNA相對表達(dá)量（±s）

注：n=3。與對照組（0 nmol/L）比較，aP ＜0.05；bP ＜0.01。GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；PERK：蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；CHOP：C/EBP同源蛋白

雷公藤內(nèi)酯醇濃度0（對照組）12.5 nmol/L 25.0 nmol/L 50.0 nmol/L 100.0 nmol/L 200.0 nmol/L F值P值GRP78 1 1.337±0.188a 1.634±0.204b 2.380±0.190b 3.029±0.069b 3.219±0.162b 105.045＜0.01 PERK 1 1.616±0.226 2.687±0.347b 3.893±0.783b 4.664±0.380b 6.065±0.370b 62.011＜0.01 CHOP 1 1.954±0.486a 3.551±0.317b 4.652±0.284b 6.206±0.488b 7.693±0.671b 104.509＜0.01

六、雷公藤內(nèi)酯醇對A375細(xì)胞GRP78、PERK及CHOP mRNA表達(dá)的影響

不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇作用A375細(xì)胞24 h后，GRP78、PERK及CHOP mRNA的表達(dá)水平均隨雷公藤內(nèi)酯醇濃度升高而增加（表2）。其中，各雷公藤內(nèi)酯醇組細(xì)胞GRP78及CHOP mRNA水平與陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而PERK mRNA表達(dá)量除12.5 nmol/L濃度外，各濃度雷公藤內(nèi)酯醇組與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。GRP78除100 nmol/L與200 nmol/L濃度組間沒有差異外，其余各雷公藤內(nèi)酯醇組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PERK及CHOP在各濃度組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

討 論

雷公藤內(nèi)酯醇是從中藥雷公藤中分離的有效活性成分，對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用［4，6?7］。我們曾報道雷公藤內(nèi)酯醇能夠誘導(dǎo)人黑素瘤A375細(xì)胞凋亡［4］，但尚無雷公藤內(nèi)酯醇通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制的報道。本研究顯示，雷公藤內(nèi)酯醇作用于A375細(xì)胞24 h后，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，且隨藥物濃度的增加更加明顯。CCK8檢測顯示，雷公藤內(nèi)酯醇對A375細(xì)胞的增殖抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，隨雷公藤內(nèi)酯醇濃度的增加，A375細(xì)胞凋亡率逐漸上升，提示雷公藤內(nèi)酯醇能夠促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇作用后，A375細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生損傷性變化。

未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）最重要的信號通路，是由GRP78和3個跨膜感受蛋白介導(dǎo)的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，3個蛋白分別是PERK、激活轉(zhuǎn)錄因子6和肌醇酶1。該反應(yīng)具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，適度的ERS有利于細(xì)胞在各種內(nèi)外界刺激下維持自身穩(wěn)定，主要表現(xiàn)為蛋白合成減少或增加錯誤折疊蛋白的降解［8］。但持續(xù)或過強的ERS則會引起細(xì)胞的一系列病理變化甚至凋亡［8?9］，激活下游的凋亡信號分子，觸發(fā)促凋亡信號［10］。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有C/EBP同源蛋白（CHOP）、c?Jun氨基末端激酶（JNK）和半胱氨酸天冬氨酸酶12（caspase?12）三條信號通路。因此，ERS既是細(xì)胞抵抗應(yīng)激的保護(hù)性措施，也是應(yīng)激損傷細(xì)胞的重要途徑。該應(yīng)激過程主要涉及GPR78和CHOP兩種類型的效應(yīng)分子，二者通常被當(dāng)做檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志［5］。其中GRP78是ERS激活的特征性標(biāo)志物，主要促進(jìn)細(xì)胞生存；而CHOP被認(rèn)為是ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］，綜合二者可以反映細(xì)胞ERS相關(guān)性凋亡。本研究顯示，PERK及pPERK蛋白相對表達(dá)量和PERK mRNA水平均隨藥物濃度升高增加，證實雷公藤內(nèi)酯醇作用下PERK內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路被激活，參與誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。雷公藤內(nèi)酯醇作用下A375細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)量和mRNA水平呈現(xiàn)短暫表達(dá)上升趨勢，隨藥物濃度的增加而增加，提示藥物作用下細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性反應(yīng)。但是，隨著雷公藤內(nèi)酯醇作用時間的延長，GRP78蛋白表達(dá)量逐漸下降，原因可能為持續(xù)發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動了細(xì)胞的反應(yīng)性凋亡，GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白的抑制劑及抗凋亡分子，其表達(dá)下調(diào)有利于激活ERS下游3條信號通路，進(jìn)而激活凋亡通路，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。關(guān)于雷公藤內(nèi)酯醇作用于A375細(xì)胞后引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中是否有其他如Caspase12、JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的參與，以及起主要作用的信號通路等，尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］李小靜,李志鋒,李顯平,等.丹參酮ⅡA體外促進(jìn)黑素瘤A375細(xì)胞自噬及信號通路的實驗研究［J］.中華皮膚科雜志,2017,50（1）:29?32.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.008.

［2］Aung PP,Nagarajan P,Prieto VG.Regression in primary cuta?neous melanoma:etiopathogenesis and clinical significance［J/OL］.Lab Invest,2017.doi:10.1038/labinvest.2017.8.［published online ahead of print Feb 27,2017］.

［3］Maverakis E,Cornelius LA,Bowen GM,et al.Metastatic mela?noma ?a review of current and future treatment options［J］.Acta Derm Venereol,2015,95（5）:516?524.doi:10.2340/00015555?2035.

［4］Tao Y,Zhang ML,Ma PC,et al.Triptolide inhibits proliferation and induces apoptosis of human melanoma A375 cells［J］.Asian Pac J Cancer Prev,2012,13（4）:1611?1615.

［5］Zheng YZ,Cao ZG,Hu X,et al.The endoplasmic reticulum stress markers GRP78 and CHOP predict disease?free survival and responsiveness to chemotherapy in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat,2014,145（2）:349?358.doi:10.1007/s10549?014?2967?x.

［6］陶玥,馬鵬程,孫建方,等.雷公藤內(nèi)酯醇對人黑素瘤M14細(xì)胞系增殖與凋亡的影響［J］.中華皮膚科雜志,2012,45（9）:641?643.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2012.09.010.

［7］Hung FM,Chen YL,Huang AC,et al.Triptolide induces S phase arrest via the inhibition of cyclin E and CDC25A and triggers apoptosis via caspase?and mitochondrial?dependent signaling pathways in A375.S2 human melanoma cells［J］.Oncology Reports,2013,29（3）:1053?1060.doi:10.3892/or.2013.2230.

［8］Moriya S,Che XF,Komatsu S,et al.Macrolide antibiotics block autophagy flux and sensitize to bortezomib via endoplasmic reticulum stress?mediated CHOP induction in myeloma cells［J］.Int J Oncol,2013,42（5）:1541?1550.doi:10.3892/ijo.2013.1870.

［9］Zhang Q,Liu J,Chen S,et al.Caspase?12 is involved in stretch?induced apoptosis mediated endoplasmic reticulum stress［J］.Apoptosis,2016,21（4）:432?442.doi:10.1007/s10495?016?1217?6.

［10］Sanchez?Lopez E,Zimmerman T,Gomez dPT,et al.Choline kinase inhibition induces exacerbated endoplasmic reticulum stress and triggers apoptosis via CHOP in cancer cells［J］.Cell Death Dis,2013,4:e933.doi:10.1038/cddis.2013.453.

［11］Li H,Zhu X,Fang F,et al.Down?regulation of GRP78 enhances apoptosis via CHOP pathway in retinal ischemia?reperfusion injury［J］.Neurosci Lett,2014,575:68 ?73.doi:10.1016/j.neulet.2014.05.042.