元慧杰 周生儒 劉芝翠 朱海琴 許人超 鄭捷 潘萌

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科

天皰瘡是一種以皮膚、黏膜為靶器官的自身免疫性大皰性皮膚病，通常認(rèn)為外周血循環(huán)中的特異性抗橋粒芯糖蛋白1（desmoglein1，Dsg1）和（或）Dsg3抗體通過破壞角質(zhì)形成細胞間的橋粒結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致局部棘層松解，形成表皮內(nèi)水皰［1］。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為［2?3］，天皰瘡的致病性自身抗體來源于外周血循環(huán)中的B細胞，皮膚僅作為靶器官而發(fā)生疾病。因此，目前對于天皰瘡免疫機制的研究多集中于外周血B淋巴細胞及其自身抗體的致病性［4?5］，而皮損局部的免疫應(yīng)答反應(yīng)則未曾有報道。為明確天皰瘡患者皮損局部是否存在抗原特異性B淋巴細胞的浸潤，是否可以在局部產(chǎn)生特異性抗體，我們對尋常型天皰瘡患者皮損局部B淋巴細胞的表型及其功能進行探討。

一、對象與方法

（一）對象：2013年9月至2015年6月初診、未經(jīng)治療并隨訪于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的35例尋常型天皰瘡患者（皮膚黏膜型），均根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理、免疫熒光和自身抗體檢測確診。健康對照皮膚組織來自皮膚科門診手術(shù)室接受色素痣切除術(shù)的22例患者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

（二）主要試劑和儀器：別藻藍蛋白（APC）-抗人CD19、異硫氰酸熒光素（FITC）-抗人IgG流式抗體產(chǎn)自美國BD公司，Alexa?Fluor?647-抗人DYKDDDDK標(biāo)簽抗體、藻紅蛋白（PE）-抗人His標(biāo)簽抗體產(chǎn)自美國CST公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、透明質(zhì)酸酶、DNA酶及Ⅴ型膠原酶產(chǎn)自美國Sigma?Aldrich公司，抗人Dsg1、Dsg3抗體ELISA試劑盒產(chǎn)自日本MBL公司，LymphoprepTM淋巴細胞分離液產(chǎn)自挪威Axis?shield公司。FACS CantoⅡ及LSR Fortessa型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。重組人Dsg1、Dsg3由清泓生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

（三）方法：

1.皮損局部單個核細胞分離：取12例健康對照正常皮膚和20例尋常型天皰瘡患者初發(fā)水皰或糜爛皮損組織各1 cm×1 cm，在含Ⅴ型膠原酶、DNA酶及透明質(zhì)酸酶的消化液中37℃消化2 h，用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法（800×g，15 min）分離獲得單個核細胞。

2.流式細胞儀檢測CD19+B細胞、CD19+IgG+B細胞、CD19+CD27+記憶B細胞及CD19+IgD+初始B細胞：每2×105個皮損單個核細胞重懸于100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清）中，根據(jù)不同流式抗體組合，按照抗體與培養(yǎng)液的體積比例1∶100分別加入熒光抗體，用FACS CantoⅡ流式細胞儀和FlowJo軟件檢測和分析。

3.流式細胞儀檢測表面識別Dsg1、Dsg3的CD19+B細胞：每2×105個皮損單個核細胞重懸于100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清）中，分別加入0.5 μg重組人Dsg1和Dsg3，室溫孵育1 h，培養(yǎng)液洗滌1次，根據(jù)不同流式抗體組合，按照抗體與培養(yǎng)液的體積比例1∶100分別加入熒光抗體，用FACS CantoⅡ流式細胞儀和FlowJo軟件檢測和分析。

4.皮損局部單個核細胞的體外培養(yǎng)及上清液中抗Dsg1、抗Dsg3抗體檢測：每2 × 105個細胞重懸于200 μl含10%胎牛血清、200 mg/L青霉素和200 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6 d后收集上清液。

按照ELISA試劑盒的抗體檢測說明，將上清液按1∶101稀釋后加入微孔中，于室溫孵育1 h后洗滌，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗人IgG抗體，于室溫孵育1 h，洗滌孔板后再加入底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）于室溫孵育0.5 h，加入終止液終止反應(yīng)，采用全自動定量酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度（A值），并通過試劑盒說明中的公式（A樣本-A陰參）×100%/（A陽參-A陰參）計算培養(yǎng)上清液中抗體的滴度值。

采用受試者工作特征曲線（ROC）判斷皮損處單個核細胞產(chǎn)生特異性抗體的有效性［6］，根據(jù)ROC統(tǒng)計分析輸出的靈敏度與特異度，計算約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1），約登指數(shù)最大值所對應(yīng)的滴度值為臨界值，抗體滴度大于臨界值即為陽性。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：用Graphpad 5.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示；用非參數(shù)Mann?WhitneyU檢驗及Welch′sT檢驗比較兩組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）尋常型天皰瘡患者皮損局部B淋巴細胞比例：流式細胞儀檢測15例（分離的單個核細胞數(shù)≥2×105）尋常型天皰瘡患者皮損及12例健康對照皮膚分離后的單個核細胞，患者組淋巴細胞比例為（17.95±3.85）%，健康對照組為（7.83±1.29）%（圖1A），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.49，P=0.023 4）?；颊呓MCD19+B細胞比例為（4.27±1.13）%，健康對照組為（0.61± 0.31）%（圖1B），差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（U=13.00，P=0.000 2）。

（二）患者皮損局部CD19+B細胞為Dsg特異性B細胞：15例天皰瘡患者皮損局部CD19+B淋巴細胞中，表達IgG的細胞比例為（38.33±5.56）%，3例天皰瘡患者皮損局部CD19+B淋巴細胞中表面特異性識別Dsg1與Dsg3的細胞比例分別為（12.87 ± 1.267）%、（10.42 ± 1.243）%。

（三）尋常型天皰瘡患者皮損局部單個核細胞體外培養(yǎng)后產(chǎn)生抗Dsg1及抗Dsg3特異性抗體：將20例尋常型天皰瘡患者皮損與10例健康對照皮膚局部單個核細胞分別體外培養(yǎng)6 d后，患者組培養(yǎng)上清液中抗Dsg1與Dsg3抗體滴度分別為（4.89 ± 1.56）、（35.45 ± 13.03）U/ml，健康對照組分別為（-0.36 ± 0.25）U/ml、（-0.29 ± 0.29）U/ml，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（U值為13.0、5.0，P＜0.05）。培養(yǎng)上清液中抗Dsg1和Dsg3抗體的曲線下面積分別為0.938與0.975（圖2），滴度臨界值分別為0.64和0.92?；颊咂p單個核細胞培養(yǎng)上清液抗Dsg1和Dsg3抗體分別有17例（85%）、19例（95%）為陽性。

三、討論

我們在臨床上觀察到，一些復(fù)發(fā)天皰瘡患者的皮損通常發(fā)生在與初發(fā)皮疹完全相同的部位，對復(fù)發(fā)患者不增加系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素用量，僅加強外用治療，皮疹就能得到控制；而部分落葉型或紅斑型天皰瘡患者，僅外用糖皮質(zhì)激素治療，皮疹也可好轉(zhuǎn)。這引起了我們對天皰瘡患者皮損局部免疫環(huán)境研究的興趣。

過去的研究認(rèn)為，B淋巴細胞通常不在皮膚聚集［7］。但在炎癥性皮膚病的動物模型及人類臨床研究中發(fā)現(xiàn)，B細胞可發(fā)揮促炎及抗炎作用［8］。目前已在皮膚利什曼?。?］、彌漫性皮膚硬化［10］和特應(yīng)性皮炎［11］等皮損真皮部位發(fā)現(xiàn)有B細胞浸潤，B細胞與皮膚固有免疫細胞及T細胞相互作用共同參與皮膚炎癥發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，B細胞浸潤于天皰瘡患者皮損局部，這可能是因為皮損部位基質(zhì)細胞或T淋巴細胞表達趨化因子（CXCL13、CCL19等）與B細胞表面的趨化因子受體（CXCR5或CCR7）結(jié)合，趨化B細胞至患者皮損部位［12?14］。

圖1 尋常型天皰瘡患者皮損處與健康對照皮膚單個核細胞中淋巴細胞與CD19+B細胞的比例 1A：淋巴細胞比例；1B：CD19+B細胞比例

圖2 體外培養(yǎng)局部單個核細胞產(chǎn)生抗橋粒芯糖蛋白1（Dsg1）、Dsg3抗體的受試者工作特征曲線 曲線下面積分別為0.938、0.975

皮膚局部的免疫過程可能受到機體整體免疫的影響，而Geherin等［15］在綿羊肉芽腫模型中發(fā)現(xiàn)，皮膚中聚集的B細胞表型不同于淋巴結(jié)中的B細胞，其表面MHCⅡ、CD1和CD80/86表達增加，有利于T細胞活化，同時皮損局部B細胞和抗體產(chǎn)生細胞的聚集增加了局部抗體的濃度，進而加重了自身免疫的發(fā)生。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，尋常型天皰瘡患者皮損局部浸潤的B細胞表面高表達IgG，可與Dsg1與Dsg3特異性結(jié)合，可能是由于局部的T、B細胞容易被活化。Mahanonda等［16］發(fā)現(xiàn)，正常齒齦及齒齦炎組織有CD20+/27+記憶性B細胞浸潤，表面表達IgG和IgA，在體外用Toll樣受體7/8（R848）及白細胞介素2刺激后可分化為分泌IgG和IgA的抗體分泌細胞。本研究中，天皰瘡患者皮損局部浸潤的B細胞，體外培養(yǎng)6 d后產(chǎn)生抗Dsg1和Dsg3抗體，提示浸潤的B細胞可分化成為抗體分泌細胞，可能參與天皰瘡的發(fā)生。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，尋常型天皰瘡患者皮損局部有大量淋巴細胞浸潤，其中包括B淋巴細胞，這些B細胞表面表達IgG，并以記憶性B細胞為主，可與Dsg1、Dsg3特異性結(jié)合，在體外培養(yǎng)后，可產(chǎn)生抗Dsg1與Dsg3特異性抗體，在皮損形成過程中發(fā)揮重要作用。

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