許新雅 鄭躍 許慶芳 黎鈺瑩 黃云芬 龔子鑒 陸春 賴維

510630廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院皮膚科

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）是蛋白質(zhì)、脂類、核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖通過非酶糖化反應(yīng)生成不易降解的大分子棕色產(chǎn)物［1］。研究發(fā)現(xiàn)，AGE在光老化皮膚中大量堆積，并在光老化多個環(huán)節(jié)中起重要作用［2］，但其堆積機制不明。研究發(fā)現(xiàn)，通過胞外途徑不能降解光老化皮膚組織中AGE，基質(zhì)金屬蛋白酶在光老化皮膚和皮膚成纖維細胞中表達和活性升高，但依然不能降解AGE［3］；胃蛋白酶和蛋白酶K能降解AGE，但它們只存在于胃腸消化系統(tǒng)中［4］。然而，AGE可被巨噬細胞、成纖維細胞等胞吞后被溶酶體或泛素蛋白酶體降解清除［5］。光老化皮膚成纖維細胞是否對吞入胞內(nèi)AGE的降解變緩，進而在皮膚AGE堆積中起作用，目前還不清楚。我們檢測AGE-牛血清白蛋白（BSA）在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)堆積和降解情況，探討光老化皮膚AGE堆積機制。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細胞：正常皮膚組織來自中山大學附屬第三醫(yī)院泌尿外科3名兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，年齡5～9歲。本研究通過中山大學附屬第三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患兒家屬均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）及青、鏈霉素均為美國Gibco公司產(chǎn)品；AGE?BSA為美國Biovision公司產(chǎn)品；細胞衰老β半乳糖苷酶（SA?β?Gal）試劑盒為美國Cell signaling technology公司產(chǎn)品；LysoTracker RedDND?99為美國ThermoFisher公司產(chǎn)品；SYTO?13為美國Life Technologies公司產(chǎn)品；細胞凋亡試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。UVA紫外線照射儀（Sigma SS?03A，燈管為 Philips UVA TL10RS，波長320～400 nm）與UVA照射計均產(chǎn)自上海希格瑪高科技有限公司。流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細胞培養(yǎng)：取兒童包皮參照文獻［6］分離培養(yǎng)皮膚成纖維細胞，第3代細胞凍存。細胞復蘇后10代以內(nèi)的細胞行后續(xù)實驗。在AGE?BSA處理細胞3 d前及AGE?BSA孵育細胞過程中，均以含2%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)各組細胞。

2.連續(xù)UVA照射誘導成纖維細胞光老化：實驗分為連續(xù)UVA照射組和空白對照組。將3～10代成纖維細胞按1×106/皿接種于直徑6 cm的細胞培養(yǎng)皿，待細胞長到70%融合時，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后每皿加2 ml PBS。將UVA照射組細胞置于UVA輻照儀下，細胞距離光源15 cm，平均照射功率為12.7 mW/cm2，設(shè)置單次照射時間為780 s，照射劑量為9.9 J/cm2［7?9］，每日同一時間照射1次，連續(xù)照射14 d?？瞻讓φ战M細胞加入PBS后置于超凈臺避光。

3.CCK8法檢測皮膚成纖維細胞增殖活性：將末次UVA照射后成纖維細胞按5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含100 μl細胞培養(yǎng)液，每組各設(shè)3個復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μl CCK8試劑，37℃孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450 nm處吸光度（A值）。細胞活性（%）=（AUVA照射組-A空白孔）/（A對照組-A空白孔）×100%，實驗重復3次，取均值。

4.β半乳糖苷酶染色檢測老化比率：末次UVA照射后48 h去除細胞培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，按照試劑盒說明書檢測細胞老化。光鏡下觀察結(jié)果，老化細胞胞質(zhì)被染成藍色，每皿至少計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞所占百分比。實驗重復3次，取均值。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：末次UVA照射后，用胰酶消化細胞，調(diào)整細胞為1×106/ml。每組取1 ml細胞，預冷PBS洗滌3次后細胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液。加入10 μl膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素及10 μl碘化丙錠，輕輕混勻，4℃反應(yīng)30 min。加入300 μl結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取均值。

6.流式細胞儀檢測吞入胞內(nèi)的AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)的堆積：因AGE?BSA具有自發(fā)性熒光，激發(fā)光波長（λex）為370 nm、發(fā)射光波長（λem）為440 nm，可用流式細胞儀檢測細胞在該波長下的熒光強度以定量胞內(nèi)AGE?BSA。取原代成纖維細胞分為4組：光老化組（以UVA照射誘導光老化），非光老化組（不做處理），光老化+AGE組（以UVA照射誘導光老化后加入AGE?BSA孵育），非光老化+AGE組（未誘導光老化細胞中加入AGE?BSA孵育）。參照前期研究［10］，200 mg/L AGE?BSA是最大無細胞毒性濃度。在各組細胞中加或不加入200 mg/L AGE?BSA，孵育4、8、16、24、48、72 h收集細胞，預冷PBS洗滌3次，200 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測并記錄激發(fā)波長370 nm處熒光。實驗重復3次，取均值。

7.激光共聚焦定位、半定量細胞內(nèi)AGE?BSA：分組同上。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，在AGE?BSA孵育8 h時，光老化和未老化細胞內(nèi)AGE?BSA含量最高，因此在孵育8 h時檢測各組細胞內(nèi)AGE?BSA。PBS洗滌細胞2次后，加入含有70 nmol/L LysoTracker Red DND?99（標記溶酶體膜）的細胞培養(yǎng)基避光孵育1 h，PBS洗滌3次，再加入含有125 nmol/L SYTO 13（標記細胞核）的培養(yǎng)基避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，每皿隨機取3個無重疊視野拍攝并計算AGE?BSA平均熒光強度（油鏡，×63）。在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到3種熒光：AGE?BSA呈藍色，LysoTracker Red DND?99標記的溶酶體呈紅色，SYTO13標記的細胞核呈綠色。實驗重復3次，取均值。

8.ELISA檢測吞入胞內(nèi)的AGE?BSA在光老化/非光老化細胞內(nèi)降解差異：分組同上。在各組細胞中加入或不加入200 mg/L AGE?BSA，孵育8 h后去除AGE?BSA，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h，收集8 h和32 h點各組細胞總蛋白并定量。按照AGE ELISA檢測試劑盒說明操作，最后根據(jù)各樣品的A405值計算AGE濃度。根據(jù)（T8h-T32h）/T8h計算AGE?BSA在各組細胞中的降解率。實驗重復3次取均值。

9.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)均以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），各組間兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、連續(xù)UVA照射對成纖維細胞老化及凋亡的影響

UVA照射組細胞活性為（78±6.1）%，較對照組（100%）明顯下降（t=7.559，P＜0.05）。UVA照射組和對照組β半乳糖苷酶染色陽性率分別為（81.37±2.90）%和（8.03±0.31）%，前者顯著高于后者（t=43.524，P＜0.05）。UVA照射組細胞凋亡率為（20±2.5）%，顯著高于對照組細胞［（10± 1.1）%，t=14.075，P＜ 0.05］。

二、吞入胞內(nèi)AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)堆積差異

圖1 流式細胞儀檢測晚期糖基化終末產(chǎn)物-牛血清白蛋白在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)的堆積差異

見圖1。200 mg/L AGE?BSA孵育成纖維細胞后，光老化和非光老化成纖維細胞內(nèi)AGE?BSA熒光強度均逐漸升高，在8 h點達到最高，此后逐漸下降，24 ～ 72 h間變化差異無統(tǒng)計學意義。4、8、16、24、48、72 h時光老化+AGE組、非光老化+AGE組AGE?BSA熒光強度均顯著高于相應(yīng)時間點無AGE?BSA孵育的光老化組及非光老化組（均P＜0.05）；光老化細胞內(nèi)AGE?BSA熒光強度顯著高于非光老化細胞（P＜0.05）。

三、激光掃描共聚焦顯微鏡定位、半定量細胞內(nèi)AGE?BSA

見圖2。激光掃描共聚焦顯微鏡鏡下發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)發(fā)藍色熒光的AGE?BSA與發(fā)紅色熒光的溶酶體位置一致，表明吞入胞內(nèi)AGE?BSA主要位于溶酶體內(nèi)。用ImageJ圖像分析軟件行灰度掃描半定量藍色熒光，光老化+AGE組、光老化組、非光老化+AGE組、非光老化組AGE?BSA熒光強度分別為292.63 ± 2.58、227.33 ± 1.11、249.33 ± 0.71、182.73 ±2.22，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=1887.25，P＜0.05）。LSD?t檢驗發(fā)現(xiàn)，光老化+AGE組顯著高于其他3組（均P＜0.05），非光老化+AGE組顯著高于非光老化組（P＜0.05）。

四、AGE?BSA在光老化/非光老化細胞內(nèi)降解差異

見表1。孵育32 h時光老化細胞AGE濃度較8 h下降（7.6±1.4）%，而非光老化細胞AGE濃度下降（14.6±1.2）%，前者顯著低于后者（t=6.604，P＜0.05）。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察晚期糖基化終末產(chǎn)物-牛血清白蛋白（AGE?BSA）在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)的堆積（油鏡，× 63） 藍色：AGE?BSA，紅色：溶酶體

表1 AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)的降解差異（±s）

表1 AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內(nèi)的降解差異（±s）

注：n=3。AGE?BSA，晚期糖基化終末產(chǎn)物-牛血清白蛋白

組別非光老化組非光老化+AGE組光老化組光老化+AGE組AGE（ng/mg）8 h 275.80±5.53 421.24±8.04 321.67±3.90 495.27±8.60降解率（%）32 h 274.23±5.58 359.83±8.83 320.60±3.83 457.43±14.39 0.57±0.14 14.60±1.20 0.33±0.90 7.60±1.40

討 論

研究顯示，AGE在光老化皮膚大量堆積［2］，可促進活性氧簇生成和抑制超氧化物歧化酶活性［1］，促進角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞凋亡，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達，使膠原纖維和彈性纖維變性，與細胞表面受體結(jié)合后引發(fā)生物學效應(yīng)等，進而在光老化中起重要作用。因此，越來越多的學者認為干預AGE堆積可以改善光老化［11?12］。然而，光老化皮膚AGE堆積機制目前還不明確。

本研究顯示，以無細胞毒性劑量UVA連續(xù)照射成纖維細胞，細胞活性顯著下降，而β半乳糖苷酶染色陽性率和細胞凋亡率均顯著升高，表明連續(xù)UVA照射可成功誘導成纖維細胞光老化。接著，我們驗證光老化/非光老化皮膚成纖維細胞是否可胞吞胞外AGE，發(fā)現(xiàn)AGE?BSA孵育的光老化和非光老化細胞內(nèi)AGE?BSA熒光強度均分別顯著高于無AGE?BSA孵育的光老化及非光老化細胞，且光老化細胞內(nèi)AGE?BSA熒光強度顯著高于非光老化細胞；共聚焦顯微鏡定位發(fā)現(xiàn)，吞入胞內(nèi)的AGE?BSA主要位于溶酶體內(nèi)。以上結(jié)果表明，光老化和非光老化成纖維細胞均可胞吞胞外AGE?BSA，并將吞入胞內(nèi)的AGE?BSA輸送至溶酶體內(nèi)降解，提示成纖維細胞很可能在皮膚AGE降解及光老化皮膚AGE堆積中起重要作用。我們的結(jié)果還提示，AGE?BSA在光老化細胞內(nèi)堆積明顯高于正常成纖維細胞，由于一種物質(zhì)在溶酶體內(nèi)堆積常提示該物質(zhì)降解減少［13］，故推測AGE?BSA在光老化成纖維細胞溶酶體內(nèi)的降解很可能低于非光老化成纖維細胞。

為驗證推測，我們以AGE?BSA孵育細胞8 h后去除，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用ELISA檢測各組AGE濃度在這兩時點間的變化，發(fā)現(xiàn)光老化細胞AGE濃度下降程度顯著低于非光老化細胞AGE，表明AGE?BSA在光老化細胞內(nèi)降解明顯低于非光老化細胞，揭示光老化抑制成纖維細胞對吞入胞內(nèi)AGE的降解，進而促進AGE在光老化皮膚中的堆積。光老化通過什么機制抑制AGE在成纖維細胞內(nèi)降解目前還不清楚。Grimm等［5］以純化組織蛋白酶D、B以及20S蛋白酶體等分別孵育AGE，發(fā)現(xiàn)20S蛋白酶體完全不能降解AGE，組織蛋白酶D、B能降解AGE，其中組織蛋白酶D降解活性顯著高于B。本研究發(fā)現(xiàn)，吞入成纖維細胞內(nèi)的AGE?BSA主要位于溶酶體內(nèi)，提示溶酶體蛋白酶很可能在胞內(nèi)AGE降解中起主導作用。我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)，溶酶體組織蛋白酶B、D及K在光老化皮膚及成纖維細胞中表達均降低［14］，提示光老化很可能通過降低組織蛋白酶B、D及K表達抑制吞入成纖維細胞內(nèi)的AGE降解。何種蛋白酶在皮膚成纖維細胞降解胞內(nèi)AGE中起關(guān)鍵作用，光老化是否通過抑制該酶表達和活性進而影響AGE胞內(nèi)降解有待進一步研究。

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