楊旅軍 張明君 謝思田 葉丹彥

510041廣東，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院燒傷整形外科（楊旅軍、張明君、謝思田），轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心（楊旅軍、葉丹彥）

隱性營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥（recessive dystrophic epidermolysis bullosa，RDEB）是大皰性表皮松解癥中最嚴(yán)重的亞型，皮膚反復(fù)發(fā)生水皰、破潰，也可導(dǎo)致食道狹窄、小口畸形、全身廣泛瘢痕形成［1］。手部瘢痕攣縮畸形往往較為嚴(yán)重，由于表皮包裹，形成“拳擊手套”樣改變，嚴(yán)重影響生活工作質(zhì)量，治療主要是瘢痕松解和自體皮片移植。自體皮片雖然來自未受損區(qū)域，但細(xì)胞編碼Ⅶ型膠原基因仍然異常，移植后在摩擦和微小的創(chuàng)傷下皮膚會(huì)頻繁發(fā)生水皰、破潰和瘢痕攣縮，且患者自身無(wú)法反復(fù)提供全厚皮片。在病損面積較大、自體可用供皮面積不足的情況下，可采用自體皮膚細(xì)胞構(gòu)建的活性皮膚替代物（living skin equivalent，LSE）修復(fù)創(chuàng)面［2］。有實(shí)驗(yàn)表明，異體成纖維細(xì)胞皮內(nèi)注射后無(wú)明顯的排異反應(yīng)，并可以合成分泌Ⅶ型膠原分布到基底膜區(qū)域，形成良好的基底膜-真皮連接［3］。我們檢測(cè)1例RDEB患者直系親屬（生母）的皮膚，證實(shí)其有正常的Ⅶ型膠原分布，然后將患者和其母親的皮膚細(xì)胞混合，構(gòu)建基底膜有Ⅶ型膠原分布的LSE來移植修復(fù)患者手部瘢痕攣縮松解后的皮膚缺損創(chuàng)面并定期隨訪，評(píng)估自體與異體細(xì)胞混合構(gòu)建的LSE治療基因缺陷型表皮松解癥的效果。

資料與方法

一、臨床資料

患者女，22歲，自出生后全身多處皮膚在摩擦后反復(fù)出現(xiàn)表皮松解、水皰形成。右手逐漸形成瘢痕攣縮，影響功能。數(shù)年前來我院皮膚科及整形外科就診，行病理學(xué)檢查，確診為RDEB，并行瘢痕松解、自體全厚皮移植術(shù)。數(shù)月后術(shù)區(qū)因再次反復(fù)水皰破潰、愈合，形成瘢痕攣縮（圖1）。體檢：枕部、腰背部易摩擦部位大片瘢痕，手足瘢痕攣縮畸形。右手2～4指瘢痕粘連攣縮，掌指關(guān)節(jié)、指指關(guān)節(jié)屈曲畸形，不能伸直，抓握功能受限。

二、治療方法

我們采用自體及直系親屬細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的LSE修復(fù)創(chuàng)面，該方案經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.細(xì)胞培養(yǎng)：局麻下切取患者及生母上臂內(nèi)側(cè)各約1 cm2正常皮膚，在超凈工作臺(tái)上剔除脂肪，修薄真皮部分后放入分散酶（0.4 g/L）溶液中，4℃靜置過夜，分離表皮和真皮。置表皮片于2.5 g/L胰蛋白酶溶液中，37℃處理10 min，獲得表皮角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，種于Ⅰ型膠原涂布的培養(yǎng)皿（日本Iwaki公司），添加Epilife表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Lifescience公司），于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)傳代。將表皮層剝離后的真皮切成直徑1～2 mm的組織塊，使其緊密貼附于培養(yǎng)皿的底部，添加2%患者自身血清于低血清間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（MeSup，廣州美薩生物科技有限公司）中，于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，5 d后成纖維細(xì)胞自真皮組織塊的周圍長(zhǎng)出并增殖、游走，細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將3代前的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和4代前的真皮成纖維細(xì)胞凍存于液氮中。使用前進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、接種、培養(yǎng)，達(dá)到約90%融合后，收集細(xì)胞，利用第4代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和第5代成纖維細(xì)胞構(gòu)建活性全層皮膚LSE。

2.構(gòu)建以羊膜（amnion，AM）為基質(zhì)的活性皮膚替代物（AM?LSE）：羊膜來自足月健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦（與患兒無(wú)親緣關(guān)系）胎盤，在超凈工作臺(tái)上清洗去除血液、蛻膜等。將羊膜置于0.02%乙二胺四乙酸中37℃孵育30 min后，在解剖顯微鏡下用細(xì)胞刮子刮除羊膜上皮，清洗，修剪成5 cm×5 cm大小羊膜片，4℃冷藏備用。羊膜供體簽署知情同意書授權(quán)使用。

在添加自體人血清（2%）的MeSup培養(yǎng)基中，調(diào)整成纖維細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml（自體及親屬細(xì)胞比例為1∶1）。將該細(xì)胞混懸液以0.5 ml/cm2滴注在羊膜基質(zhì)面，靜置2 h，待細(xì)胞貼壁后，添加培養(yǎng)基，于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后，翻轉(zhuǎn)接種了成纖維細(xì)胞的羊膜使上皮面朝上，置于Transwell嵌入式膜培養(yǎng)皿（直徑75 mm，膜孔徑3 μm，美國(guó)Corning公司）上，在上皮面滴注表皮角質(zhì)形成細(xì)胞懸液（自體及親屬細(xì)胞比例為1∶1），濃度1 × 106個(gè)/ml，密度0.5 ml/cm2。液相下培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞達(dá)到融合后，換氣液面角化培養(yǎng)基［4］，開始?xì)庖好媾囵B(yǎng)，每2天換液1次。

3.組織學(xué)和免疫熒光觀察：來自RDEB患者和其母親的活檢皮膚標(biāo)本及氣液面培養(yǎng)10 d的AM?LSE標(biāo)本石蠟包埋，制作6 μm厚石蠟切片，行HE染色以及Ⅶ型膠原抗體（LH7.2，美國(guó)NeoMarker公司）免疫熒光染色。

4.AM?LSE皮片移植修復(fù)創(chuàng)面：臂叢麻醉，切除手掌部瘢痕，松解攣縮，充分止血后，覆蓋皮耐克人工皮（Pelnac，日本Gunze公司）（圖2A），2周后去除皮耐克的硅膠膜，刮除水腫老化的肉芽組織，創(chuàng)面充分止血（圖2B）；將AM?LSE以生理氯化鈉溶液漂洗多次，洗去培養(yǎng)基成分后，裁剪成郵票狀，貼敷于創(chuàng)面，網(wǎng)眼紗固定皮片后（圖2C、2D），填塞紗布碎片，打包包扎。術(shù)后7 d拆除敷料，常規(guī)換藥直至AM?LSE皮片完全封閉創(chuàng)面。2個(gè)月后再次行分指手術(shù)（圖3），創(chuàng)面行多Z成形并用自體與異體細(xì)胞混合AM?LSE覆蓋，術(shù)后常規(guī)更換敷料至傷口完全愈合。

結(jié) 果

一、Ⅶ型膠原免疫熒光染色結(jié)果

患者母親皮膚Ⅶ型膠原正常表達(dá)，沿基底膜線性分布，而患者皮膚未見Ⅶ型膠原表達(dá)。

二、AM?LSE的大體和組織學(xué)觀察

氣液面培養(yǎng)10 d后，羊膜表面為角化表皮層，呈淡黃色，AM?LSE質(zhì)地較韌，可牽拉不易破損（圖2C）。組織學(xué)觀察：表皮角質(zhì)形成細(xì)胞重層化、分化，基底細(xì)胞層排列規(guī)整緊密，上方可見棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層以及角質(zhì)層。成纖維細(xì)胞向羊膜基質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)生長(zhǎng)（圖4A）。免疫熒光染色可見明顯的Ⅶ型膠原沿基底膜呈線性分布（圖4B）。

圖1 隱性營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥右手瘢痕攣縮畸形 1A：手掌側(cè)；1B：手背側(cè) 圖2 瘢痕攣縮松解術(shù)和以人羊膜為基質(zhì)的活性皮膚替代物（AM?LSE）移植 2A：瘢痕攣縮松解后以皮耐克封閉創(chuàng)面；2B：2周后揭除皮耐克的肉芽創(chuàng)面；2C：術(shù)中準(zhǔn)備的AM?LSE；2D：將AM?LSE貼敷于創(chuàng)面，以油紗固定

三、術(shù)后觀察

術(shù)后7 d，AM?LSE與創(chuàng)基貼敷牢固，皮片紅潤(rùn)，完全覆蓋創(chuàng)面，未發(fā)現(xiàn)皮片移植區(qū)域新發(fā)生的水皰及破潰；術(shù)后2周，移植的AM?LSE皮片貼敷牢固，質(zhì)地柔軟，色澤與周邊皮膚沒有明顯差別，可完成握拳動(dòng)作（圖5A、5B）。分指多Z成形、自體與異體AM?LSE移植術(shù)后6周，未觀察到移植區(qū)域排異反應(yīng)、水皰形成及皮膚破潰（圖5C、5D），掌指、指指關(guān)節(jié)可自主活動(dòng)，未見攣縮。術(shù)后8個(gè)月回訪，手部移植的AM?LSE皮片色澤接近正常皮膚，質(zhì)地柔軟，未見明顯的瘢痕攣縮，患手可抓握，滿足生活自理的一般要求（圖5E、5F）。術(shù)后1年余電話隨訪，訴手部摩擦后偶有水皰形成，常規(guī)換藥后可自愈，手部抓握功能尚可。

圖3 分指手術(shù) 暴露皮膚缺損創(chuàng)面行多Z成形（3A），并用以人羊膜為基質(zhì)的活性皮膚替代物（AM?LSE）皮片覆蓋（3B） 圖4 AM?LSE組織學(xué)和免疫組化觀察 4A：AM?LSE氣液面培養(yǎng)10 d，可見具有真皮和重層分化的表皮（HE×200）；4B：Ⅶ型膠原線性分布在基底膜（×200） 圖5 術(shù)后觀察 5A、5B：首次AM?LSE皮片移植術(shù)后2周，右手可以完成一定的抓握；5C、5D：分指術(shù)后6周完全愈合，指指、掌指關(guān)節(jié)可自主活動(dòng)；5E、5F：術(shù)后8個(gè)月隨訪，右手可以完成抓握及較精細(xì)的動(dòng)作，瘢痕攣縮不明顯

討 論

應(yīng)用表皮、真皮成纖維細(xì)胞，以Ⅰ型膠原為真皮基質(zhì)構(gòu)建LSE［5］是目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)采用的技術(shù)，并獲得美國(guó)和中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證。我們研究發(fā)現(xiàn)，去上皮化人羊膜基質(zhì)層可以容納成纖維細(xì)胞的三維立體生長(zhǎng)，上皮面因?yàn)楸Ａ袅嘶啄さ幕境煞?，可更好地支持表皮角質(zhì)形成細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，構(gòu)建的AM?LSE具有更緊密排列的表皮基底細(xì)胞層、重層分化良好的表皮結(jié)構(gòu)和發(fā)育良好的基底膜，表皮真皮連接更加緊密，較Ⅰ型膠原構(gòu)建的LSE可發(fā)育出更為成熟的基底膜以及基底細(xì)胞和基底膜的緊密連接，Ⅶ型膠原的分布也更接近正常皮膚，且更易操作，移植于裸鼠背部創(chuàng)面，長(zhǎng)期存活［6?7］。在LSE的構(gòu)建過程中，采用無(wú)動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基以及棄用動(dòng)物來源的Ⅰ型膠原，使AM?LSE具備了更好的臨床適用性。

本例患者自出生以來全身皮膚反復(fù)廣泛出現(xiàn)摩擦后水皰以及瘢痕形成，綜合臨床表現(xiàn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查診斷為RDEB。3年前該RDEB患者曾接受手部瘢痕攣縮松解、自體全厚皮移植術(shù)，術(shù)后3個(gè)月，移植皮片反復(fù)發(fā)生水皰、破潰，再次形成瘢痕攣縮畸形。由于從無(wú)皮損區(qū)域采集的自體皮片同樣在基底膜區(qū)無(wú)Ⅶ型膠原構(gòu)成的錨原纖維，輕微外力下容易形成基底膜下分離出現(xiàn)水皰；而且，患者的頭枕部、腰背部、手足等易摩擦部位反復(fù)破潰，形成瘢痕，難以反復(fù)提供可行皮片移植的供皮區(qū)。故我們決定采用體外構(gòu)建活性皮膚替代物進(jìn)行瘢痕切除松解后的皮膚缺損修復(fù)。患者生母的皮膚組織Ⅶ型膠原沿基底膜走行，表達(dá)正常，無(wú)皮膚摩擦起皰病史。為了避免可能的排異反應(yīng)，我們采集患者生母的皮膚細(xì)胞并將其與患者皮膚細(xì)胞混合，以人羊膜為基質(zhì)構(gòu)建LSE。該LSE中可見沿基底膜線性分布的Ⅶ型膠原。AM?LSE氣液面培養(yǎng)7～21 d，LSE能夠維持良好的組織學(xué)形態(tài)［4］，為手術(shù)時(shí)間安排提供了較大的窗口期。

應(yīng)用以共價(jià)交聯(lián)牛膠原為主要成分的Integra等真皮支架覆蓋創(chuàng)面不僅可以提高瘢痕組織、慢性創(chuàng)面的受皮成功率，而且可以減少瘢痕形成、皮片攣縮，獲得較好的柔軟度和外觀［8?9］。皮耐克具有比Integra更弱的抗原性，創(chuàng)面的成纖維細(xì)胞和新生血管向皮耐克的基質(zhì)層長(zhǎng)入，形成一定厚度的肉芽組織，在其上移植薄斷層皮片可以達(dá)到較好的效果，減少肉芽創(chuàng)面薄斷層皮片移植后的瘢痕攣縮和色素沉著［10?11］。應(yīng)用皮耐克覆蓋手部瘢痕切除松解后的創(chuàng)面，2周后在揭去硅膠膜后的肉芽創(chuàng)面上移植AM?LSE皮片。AM?LSE聯(lián)合皮耐克修復(fù)的創(chuàng)面色澤和柔軟度都接近正常皮膚。健康異體和RDEB患者細(xì)胞混合構(gòu)建的AM?LSE中，Ⅶ型膠原表達(dá)良好，移植后8個(gè)月未出現(xiàn)水皰及破潰，較之RDEB患者自體全厚皮移植顯示出較強(qiáng)的抗摩擦性，且可以反復(fù)多次制備，提供皮源。遺憾的是，術(shù)后8個(gè)月回訪時(shí)，我們未能征得患者及家屬的同意進(jìn)行活檢來了解AM?LSE植皮手術(shù)區(qū)域Ⅶ型膠原的表達(dá)情況。自體與異體細(xì)胞AM?LSE移植后未發(fā)現(xiàn)明顯的排異反應(yīng)，可能與表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的抗原性較弱、沒有具抗原提呈特性的朗格漢斯細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等的參與［12?13］以及異體細(xì)胞來自直系親屬有關(guān)。

以人去上皮羊膜為基質(zhì)構(gòu)建的LSE，具有發(fā)育良好的基底膜結(jié)構(gòu)和更為緊密的表皮真皮連接；攜帶的正常異體皮膚細(xì)胞具有合成分泌正常Ⅶ型膠原、構(gòu)建基底膜和表皮真皮連接的能力。在修復(fù)本例RDEB患者的手術(shù)創(chuàng)面方面，自體與異體細(xì)胞混合構(gòu)建的AM?LSE優(yōu)于RDEB患者自體皮片，但其長(zhǎng)遠(yuǎn)效果還有待進(jìn)一步實(shí)踐檢驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

［1］Shinkuma S.Dystrophic epidermolysis bullosa:a review［J］.Clin Cosmet Investig Dermatol,2015,8:275?284.doi:10.2147/CCID.S54681.

［2］Killat J,Reimers K,Choi CY,et al.Cultivation of keratinocytes and fibroblasts in a three?dimensional bovine collagen?elastin matrix（Matriderm?）and application for full thickness wound coveragein vivo［J］.Int J Mol Sci,2013,14（7）:14460?14474.doi:10.3390/ijms140714460.

［3］Wong T,Gammon L,Liu L,et al.Potential of fibroblast cell therapy for recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.J Invest Dermatol,2008,128（9）:2179?2189.doi:10.1038/jid.2008.78.

［4］Yang L,Shirakata Y,Tamai K,et al.Microbubble?enhanced ultrasound for gene transfer into living skin equivalents［J］.J Dermatol Sci,2005,40（2）:105?114.doi:10.1016/j.jdermsci.2005.07.001.

［5］Bell E,Ehrlich HP,Sher S,et al.Development and use of a living skin equivalent［J］.Plast Reconstr Surg,1981,67（3）:386?392.

［6］Yang L,Shirakata Y,Shudou M,et al.New skin?equivalent model from de?epithelialized amnion membrane［J］.Cell Tissue Res,2006,326（1）:69?77.doi:10.1007/s00441?006?0208?2.

［7］Yang L,Shirakata Y,Tokumaru S,et al.Living skin equivalents constructed using human amnions as a matrix［J］.J Dermatol Sci,2009,56（3）:188?195.doi:10.1016/j.jdermsci.2009.09.009.

［8］Wood FM,Stoner ML,Fowler BV,et al.The use of a non?cultured autologous cell suspension and Integra dermal regeneration template to repair full?thickness skin wounds in a porcine model:a one?step process［J］.Burns,2007,33（6）:693?700.doi:10.1016/j.burns.2006.10.388.

［9］Kumbla PA,Yuen JC,Tait MA.Applying a dermal regenerative template in management of congenital melanocytic nevi of the hand［J］.Plast Reconstr Surg Glob Open,2015,3（9）:e515.doi:10.1097/GOX.0000000000000483.

［10］Suzuki S,Morimoto N,Yamawaki S,et al.A case of giant naevus followed up for 22 years after treatment with artificial dermis［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg,2013,66（8）:e229 ?233.doi:10.1016/j.bjps.2013.03.018.

［11］Suzuki S,Kawai K,Ashoori F,et al.Long?term follow?up study of artificial dermis composed of outer silicone layer and inner collagen sponge［J］.Br J Plast Surg,2000,53（8）:659 ?666.doi:10.1054/bjps.2000.3426.

［12］Centanni JM,Straseski JA,Wicks A,et al.StrataGraft skin substitute is well?tolerated and is not acutely immunogenic in patients with traumatic wounds:results from a prospective,randomized,controlled dose escalation trial［J］.Ann Surg,2011,253（4）:672?683.doi:10.1097/SLA.0b013e318210f3bd.

［13］Nemecek GM,Dayan AD.Safety evaluation of human living skin equivalents［J］.Toxicol Pathol,1999,27（1）:101?103.doi:10.1177/019262339902700118.