向艷麗，石思蓉，覃曉莉，趙方毓，唐鮮娥，陳顯兵，3△

（1.恩施州中心血站，2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，3.湖北民族學(xué)院生物資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施445000）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，其致病原因迄今不是很清楚［1］。RA的病變是關(guān)節(jié)組織的炎性病變，最終形成不可逆性骨關(guān)節(jié)損傷。研究表明滑膜成纖維細(xì)胞在RA的發(fā)病過(guò)程中扮演相當(dāng)重要的角色，其分泌大量前炎癥因子如白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞起關(guān)鍵作用［2］。近年來(lái)研究顯示，Thl／Th2細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子的失衡與RA的發(fā)生息息相關(guān)［3］。

Lunasin是從大豆以及其他植物中分離純化并鑒定出的一個(gè)43氨基酸殘基多肽，具有抗氧化和抗炎等特性［4，5］。本實(shí)驗(yàn)中，給予RA大鼠不同劑量的Lunasin進(jìn)行灌胃處理，觀察Lunasin對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜液中淋巴細(xì)胞的活化的影響及免疫微環(huán)境的改變，為尋找治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 多肽與試劑

大豆多肽Lunasin由上海生工合成；完全弗氏佐劑（Freund’s Adjuvant Complete，F(xiàn)CA）購(gòu)自于美國(guó) Sigma公司；所有抗體均購(gòu)自于Santa Cruz公司。MTT試劑盒和Triton X-100購(gòu)碧云天公司。

1.2 RA動(dòng)物模型制作及分組

Wistar雄性大鼠50只，體重200～240 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018）。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體重隨機(jī)分為5組（n＝10）：對(duì)照組（A組，等量生理鹽水灌胃）、模型組（B組，等量生理鹽水灌胃）、0.1 mg／kg Lunasin灌胃（C組），0.2 mg／kg Lunasin灌胃（D組），0.4 mg／kg Lunasin灌胃（E組）。其中B組和C、D、E組大鼠在右后足墊處局部一次性注射FCA 0.1 ml［8］，A組注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，室溫控制在20℃～24℃，給予普通飼料，自由進(jìn)食和飲水，治療組Lunasin灌胃每天1次。于實(shí)驗(yàn)第21天測(cè)定足跖厚度后處死大鼠取病變組織常規(guī)切片。

1.3 關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞分離

大鼠麻醉后，打開(kāi)右后足足-踝關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)滑液，肝素抗凝（20 U／ml），離心 10 min（3 000 r／min），收集上清（備用），PBS重懸沉淀物，淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）分離淋巴細(xì)胞（1 500 r／min，15 min），調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106cells／ml，流式細(xì)胞分析。

1.4 關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志的表達(dá)

采用單色熒光染色，在試管中分別加入200μl PE標(biāo)記的抗體CD69、CD25單色同型對(duì)照免疫球蛋白，再加入100μl（1×106cells／ml）細(xì)胞懸液，混勻，室溫暗處反應(yīng) 15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè)

關(guān)節(jié)滑膜液上清，按ELISA試劑盒照操作說(shuō)明，檢測(cè)IL-12、TNF-β、IL-4和 IL-10的含量變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 Lunasin減少淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并抑制滑膜細(xì)胞增生

模型組大鼠右足跖腫脹明顯，局部變紅，體積增大，厚度增加。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)滑膜組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生，提示造模成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在給予不同劑量Lunasin灌胃治療后，與模型組相比較，滑膜增生明顯得到改善，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞明顯減少（圖1）。

2.2 Lunasin抑制滑膜液中T淋巴細(xì)胞活化

流式檢測(cè)結(jié)果顯示：RA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜液中淋巴細(xì)胞CD69+和CD25+表達(dá)量均明顯增加（分別由3.72±1.09 pg／ml和 3.56±1.84 pg／ml上升到 4.52±1.32 pg／ml和 7.34±1.41 pg／ml）；而在給予不同濃度的大豆多肽 Lunasin灌胃治療后，RA大鼠滑膜組織上CD69+和CD25+表達(dá)量均受到抑制，且呈一定劑量依賴(lài)關(guān)系。當(dāng)灌胃給予模型大鼠0.2 mg／kg和 0.4 mg／kg Luansin治療后，與此對(duì)照相比，RA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞上CD25+表達(dá)量明顯下調(diào)（圖2，P＜0.05）。

Fig.1 Lunasin reduced T lymphocyte infiltration and improved synovial cell hyperplasia（HE×200）

Fig.2 Lunasin inhibited T lymphocyte activity（±s，n＝5）

2.3 Lunasin促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子向Th2型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化

RA模型組大鼠與對(duì)照組比較，滑膜液中IL-12、TNF-β含量都顯著性升高，IL-4、IL-6比對(duì)照組減少。Luansin治療后，RA實(shí)驗(yàn)大鼠關(guān)節(jié)滑膜液中IL-12以及TNF-β含量都呈下降趨勢(shì)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系，在給予0.4mg／kg Luansin治療時(shí)，Th1型細(xì)胞因子降低最大，與模型組相比達(dá)到顯著性差異。IL-4、IL-10含量則隨著Lunasin劑量的提高逐步增加，同樣在0.4 mg／kg Luansin治療時(shí)Th2型細(xì)胞因子含量與模型組相比顯著性升高（圖3）。

3 討論

Fig.3 Lunasin promoted excursion of Th1／Th2 cytokines to Th2 cytokines（±s，n＝5）

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及漿細(xì)胞浸潤(rùn)為其特征［6］。成功構(gòu)建RA大鼠模型后，給予不同劑量的大豆多肽Lunasin治療后，滑膜組織T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象得到明顯改善，滑膜細(xì)胞增生得到顯著抑制。已有大量證據(jù)表明，RA患者滑膜液中T細(xì)胞處于過(guò)度激活狀態(tài)［7］。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)RA模型鼠滑膜液中T淋巴細(xì)胞表面活化標(biāo)記物CD69+和CD25+表達(dá)量顯著上升。而在給予不同劑量大豆多肽Lunasin治療后，CD69+和CD25+表達(dá)量較模型組均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。高度活化的T淋巴細(xì)胞可以通過(guò)直接或者間接的調(diào)控方式調(diào)控巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞以及其他T細(xì)胞，從而導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子的分泌增多，引發(fā)滑膜炎癥和增生。CD69+是一種相當(dāng)敏感的T細(xì)胞活化早期表達(dá)產(chǎn)物，CD25+則是T細(xì)胞活化晚期表達(dá)產(chǎn)物［8］。從上述結(jié)果我們可以得出結(jié)論，Lunasin可以通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化而降低關(guān)節(jié)滑膜處微環(huán)境自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。

研究證實(shí)Th1／Th2型細(xì)胞因子的失衡是RA發(fā)病的重要機(jī)制之一。李景怡等［9］對(duì)41例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜液中Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)量較高，Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)量較低，認(rèn)為在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中以Th1型細(xì)胞因子極化誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生為主，這與本研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行Lunaisn治療后，可有效地降低RA模型大鼠滑膜液中Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的分泌，提示Lunasin可通過(guò)調(diào)節(jié)RA患者滑膜液中Th1／Th2型細(xì)胞因子的失衡，維持滑膜液免疫微環(huán)境穩(wěn)定，從而有利于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療與康復(fù)。

Lunasin可通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞的異常活化，扭轉(zhuǎn)h1／Th2型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的失衡達(dá)到治療RA的目的。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大豆多肽Lunasin由于具有抑制滑膜成纖維細(xì)胞增值、誘導(dǎo)其凋亡、減少滑膜成纖維細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生等作用［10］，lunasin有希望作為一種RA的潛在的、有效的候選藥物或者營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充藥物，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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