嚴(yán)嘉琦，張 云，劉方舒，蔡聽聽，童康強(qiáng)，朱 燦，胡露琦，呂淑敏

（1.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江紹興312000；2.寧波市杭州灣醫(yī)院兒科，浙江寧波315336）

人工關(guān)節(jié)（也稱假體）翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)聚乙烯（polyethylene，PE）、金屬鈦（titanium，Ti）和磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）等三類松動假體可釋放大量的磨損顆粒，這些顆?？烧T導(dǎo)假體周圍組織細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞等分泌大量的炎癥因子［1］，促進(jìn)假體周圍破骨細(xì)胞生成和骨溶解。因此，磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是假體關(guān)節(jié)松動和關(guān)節(jié)置換的主要原因之一。

假體周圍除了含上述組織細(xì)胞外，還存在著豐富的骨細(xì)胞，其數(shù)量占骨組織細(xì)胞的90%～95%。骨細(xì)胞由成骨細(xì)胞分化而來，其胞體深埋于骨陷窩中，細(xì)胞間通過其豐富的偽足彼此連接形成通訊網(wǎng)絡(luò)，維持自身生理功能或合成、分泌DMP-1及SOST等分子調(diào)控骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動而調(diào)節(jié)骨重建與骨修復(fù)［2，3］。因此，骨細(xì)胞是維持成熟骨新陳代謝的主要細(xì)胞。以往研究結(jié)果顯示PE、鈷鉻鉬合金（Co-Cr-Mo）和TCP等磨損顆粒可誘導(dǎo)骨細(xì)胞 MLO-Y4損傷［2-4］，釋放破骨細(xì)胞活化因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和 RANKL，后者促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、存活和骨溶解［1］。因此，骨細(xì)胞參與溶骨過程，可能是研究和防治假體周圍骨溶解的另一種新的靶細(xì)胞。但是，目前有關(guān)骨細(xì)胞與磨損顆粒之間的關(guān)系研究較少，而且多為體外實驗研究，不能真實地反應(yīng)體內(nèi)假體周圍的系統(tǒng)性和復(fù)雜性。

本研究擬利用前期成功構(gòu)建的磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體釋放的磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解和無菌性松動病理過程［5-7］，以小鼠顱骨溶解部位周圍骨細(xì)胞為研究對象，探討TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞損傷情況，闡明其可能作用機(jī)制，為研究和防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供新的靶細(xì)胞、新方法和新治療靶點。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型建立

SPF級雄性ICR小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心（SCXK（浙）2014-0001）。實驗前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度22℃～24℃，濕度50%～70%，動物自由進(jìn)食進(jìn)水，自然晝夜節(jié)律光照。取36只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為3組（n＝12）：假手術(shù)（Sham）組、模型（TCP）組和 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）組。腹腔注射 1.5%戊巴比妥鈉（60 mg／kg）麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm，分離皮下組織，顯露出1 cm×1 cm顱骨區(qū)域，其中Sham組進(jìn)行原位縫合。TCP組和3-MA組取TCP磨損顆粒30 mg置于小鼠顱骨中縫骨膜上縫合皮膚構(gòu)建小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體周圍磨損顆粒誘導(dǎo)假體骨溶解病理過程［5-7］。3-MA組小鼠于術(shù)后第2天顱頂皮下注射3-MA（1.0 mg／kg），2 d 1次，持續(xù)干預(yù)2周。假手術(shù)組小鼠顱骨頂皮下注射等量生理鹽水，注射時間與3-MA組一致。實驗結(jié)束后取血清和顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域）。

1.2 藥品與試劑

TCP磨損顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈；鱟試劑購自上海吳昊經(jīng)貿(mào)有限公司；SOST和 DMP-1的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin-V／PI凋亡檢測試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液和HE染色液購自上海碧云天生物有限公司；3-MA購自美國 Selleck公司；DMP-1、SOST、Beclin-1、LC-3和β-actin等抗體購自美國Cell Signaling公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3 Micro-CT掃描分析假體周圍骨溶解

小鼠顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，行Micro-CT掃描（條件為電壓 59 kV、電流 167μA、深度 16 bit、曝光時間 295 ms，分辨率為9.18μm）。將所有標(biāo)本以完整骨組織為興趣區(qū)域（region of interes，ROI）進(jìn)行三維重建，應(yīng)用三維重建處理軟件和ABA專用骨骼分析軟件計算顱骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BVF）和骨吸收孔數(shù)量的變化。

1.4 ELISA法檢測血清中DMP-1和SOST水平

通過摘小鼠眼球取血，置于4℃冰箱放置30 min，經(jīng)1 500 r／m離心10 min后取上層血清。利用牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 1（dentin matrix protein 1，DMP-1）和骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）的ELISA試劑盒檢測小鼠血清中DMP-1和SOST水平。

1.5 HE染色觀察假體周圍骨細(xì)胞活性

顱骨經(jīng)10%甲醛固定 48 h和10%EDTA（pH 7.4）脫鈣2周后進(jìn)行石蠟包埋，后經(jīng)切片機(jī)對顱骨矢狀面連續(xù)切片 （5μm），脫蠟后行HE染色。置于IX70顯微鏡觀察假體周圍骨細(xì)胞活性及死亡（即空骨陷窩）情況變化，應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0（美國MediaCybernetics公司）軟件分析單位面積內(nèi)空骨陷窩數(shù)。

1.6 骨細(xì)胞的獲取

參照Prideaux等［8］方法分離骨細(xì)胞。顱骨去除軟組織和骨膜后，小鼠顱骨與0.2%IV型膠原酶溶液（用含 70 mmol／L NaCl，10 mmol／L NaHCO3，60 mmol／L山梨醇，30 mmol／L KCl，3 mmol／L K2HPO4，1 mmol／L CaCl2，0.1%BSA，0.5%葡萄糖 和 25 mmol／L HEPES）在 37℃培養(yǎng)箱中孵育 20 min。去除上清液，顱骨碎片在 37℃與含 5 mmol／L EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min，中間用移液器吹打1次。PBS沖洗后，重復(fù)以上消化步驟4次，收集最后2步消化后的上清液。經(jīng)1 500 r／min離心10 min后取下層骨細(xì)胞。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)定量分析骨細(xì)胞凋亡［9］

骨細(xì)胞與5μl Annexin V-FITC／碘化丙啶（propidium iodide，PI），10μl輕輕混勻后，避光室溫溫育15 min。然后加入200μl PBS并混勻，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長為488 nm，檢測發(fā)射波長 575 nm（Ex：488 nm，Em：575 nm）。

1.8 Western blot法檢測假體周圍骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)［10］

骨細(xì)胞加入RIPA（100μl）裂解液冰上裂解30 min。經(jīng)12 000 r／min離心15 min收集上清液即為總蛋白，通過BCATM試劑盒檢測各組骨細(xì)胞總蛋白濃度。各組蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔源性一抗DMP-1（1∶500）、SOST（1∶500）、Beclin-1（1∶1 000）、LC-3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni矯正的 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TCP磨損顆粒對假體周圍骨溶解的影響

Micro-CT分析和三維重建結(jié)果顯示：與Sham組相比，TCP組小鼠顱骨正中矢狀縫發(fā)生明顯骨溶解（圖1），BMD、BV／TV和骨吸收孔數(shù)顯著增加（P＜0.05，表1），表明 TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨溶解，該模型可用于研究假體周圍骨細(xì)胞損傷。

2.2 TCP磨損顆粒對誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞死亡的影響

HE染色顯示：與Sham組比較，TCP組假體周圍骨細(xì)胞活性明顯降低，死亡數(shù)明顯增加，表現(xiàn)為空骨陷窩數(shù)顯著增加（41.52 count／mm2），為 Sham組（12.15 count／mm2）的 3.42倍（圖 2）。流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果表明TCP組假體周圍骨細(xì)胞凋亡明顯增加，其凋亡率從4.56%增加為39.41%，與 Sham組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

Fig.1 Micro-computed tomography（Micro-CT）for the calvaria osteolysis in mice

Tab.1 Changes in bone parameters（±s，n＝3）

Tab.1 Changes in bone parameters（±s，n＝3）

BMD：Bone mineral density；BV／TV：Bone volume fraction；TCP：Tricadcium phosphate*P＜0.05 vs sham group

Group BMD（mg／cc） BV／TV（%）Number of porsity Sham 666.25±4.12 39.98±1.98 21.37±2.41 TCP 634.05±2.29*26.85±2.56*56.81±4.32*

Fig.2 Viability of periprosthetic osteocytes in the mouse calvaria（HE×200）

Fig.3 Flow analysis of osteocytes apoptosis in the mouse calvaria using Annexin-V／PI double labeling

2.3 TCP磨損顆粒對假體周圍骨細(xì)胞功能損傷的影響

ELISA和免疫印跡結(jié)果顯示：TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞功能損傷，表現(xiàn)為TCP組小鼠血清和假體周圍骨細(xì)胞中DMP-1水平及蛋白表達(dá)均明顯減少，而SOST水平及蛋白表達(dá)均顯著增加，與Sham組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2、圖 4）。

Tab.2 Changes in serum levels of DMP-1 and SOST（ng／ml，±s，n＝4）

Tab.2 Changes in serum levels of DMP-1 and SOST（ng／ml，±s，n＝4）

DMP-1：Dentin matrix protein 1；SOST：Sclerostin*P＜0.05 vs sham group

Group DMP-1 SOST Sham 56.36±5.31 34.78±3.04 TCP 22.13±2.70* 87.65±7.16*

Fig.4 Protein expression of DMP-1 and SOST in the calvaria osteocytes

2.4 TCP磨損顆粒對假體周圍骨細(xì)胞自噬的影響

Western blot結(jié)果顯示：與Sham組比較，TCP組假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為TCP組小鼠假體周圍骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)顯著增加，LC-3I向 LC-3II轉(zhuǎn)換明顯增加，造成 LC-3II／LC-3I升高，Beclin-1表達(dá)和LC-3II／LC-3I比值分別增加為Sham組的2.53和1.73倍（圖 5）。

Fig.5 Protein expression of Beclin-1 and LC-3 in the calvaria osteocytes

2.5 3-MA對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷影響的影響

與TCP組比較，3-MA組假體周圍骨細(xì)胞損傷明顯加重，表現(xiàn)為空骨陷窩數(shù)和骨細(xì)胞凋亡率顯著增加，分別增加為 TCP組的1.70倍和 1.65倍（P＜0.05，表 3）。

3 討論

本研究首先通過Micro-CT分析證實了TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)小鼠顱骨中縫發(fā)生骨溶解，成功模擬了關(guān)節(jié)假體周圍磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解病理過程，與以往報道結(jié)果基本一致［5-7］。因此，該模型可用于研究磨損顆粒所致的假體周圍骨細(xì)胞損傷。在此基礎(chǔ)上，本研究以假體周圍含量豐富的骨細(xì)胞為研究對象，探討TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞損傷情況。結(jié)果顯示TCP磨損顆粒可抑制假體周圍骨細(xì)胞活性，誘導(dǎo)骨細(xì)胞死亡，增加空骨陷窩數(shù)量，釋放能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、存活和骨溶解的破骨細(xì)胞活化因子 TNF-α、IL-1β、IL-18和 IL-6［2-4］，促進(jìn)假體周圍骨溶解。此外，TCP磨損顆粒還能誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞功能損傷，表現(xiàn)為TCP組血清及假體周圍骨細(xì)胞中DMP-1水平及其蛋白表達(dá)明顯減少，血清SOST水平及其蛋白表達(dá)顯著增加；而DMP-1減少和（或）SOST增加均能通過骨細(xì)胞自身豐富的偽足與假體周圍成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)生通訊連接，抑制成骨細(xì)胞骨礦化和骨形成、促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和骨溶解［2，3］，調(diào)控假體周圍骨重建與骨修復(fù)。因此，TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞DMP-1水平減少和SOST水平增加可促進(jìn)假體周圍骨溶解。

Tab.3 Effect of 3-MA on osteocytes injuries in the mouse calvaria（±s，n＝4）

Tab.3 Effect of 3-MA on osteocytes injuries in the mouse calvaria（±s，n＝4）

Group Empty osteocytes lacunae（1／mm2）Apoptosis（%）Sham 12.15±1.91 4.01±1.27 TCP 41.52±7.12* 35.49±4.61*3-MA 70.43±4.78# 58.87±4.61#

大量研究表明骨細(xì)胞的數(shù)量、活性及其功能對骨量的維持和骨重建起著重要的作用［2-4，8］，而骨細(xì)胞凋亡常常伴隨著骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎等骨吸收疾病的發(fā)生，同時會引起骨脆性增加和骨修復(fù)能力減弱［11，12］。Emerton等［11］觀察到雌激素缺乏的小鼠股骨皮質(zhì)骨吸收與骨細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。2016年Cabahug-Zuckerman研究小組又發(fā)現(xiàn)后肢卸載的小鼠股骨皮質(zhì)骨和骨小梁骨細(xì)胞發(fā)生凋亡及骨丟失顯著；應(yīng)用Caspase抑制劑QVD能顯著抑制上述骨細(xì)胞凋亡骨吸收［12］。本研究發(fā)現(xiàn)TCP磨損顆粒能誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞死亡及凋亡，與TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解趨勢基本一致。推測骨細(xì)胞凋亡參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍溶解。另外，有研究證實自噬調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動［13，14］，在骨重建和骨吸收疾病中發(fā)揮重要的作用。但是，目前關(guān)于自噬參與骨細(xì)胞調(diào)控骨重建的研究并不多。Zahm等［15］研究顯示自噬標(biāo)志蛋白LC3II在正常小鼠和人的皮質(zhì)骨骨細(xì)胞中高表達(dá)；2014年又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏骨質(zhì)疏松大鼠脛骨近端骨細(xì)胞自噬，且自噬的活化與氧化應(yīng)激程度密切相關(guān)［16］；2015年 Toscani等［17］也觀察到蛋白酶抑制劑硼替佐米能減少多發(fā)性骨髓瘤患者骨細(xì)胞自噬和凋亡，促進(jìn)骨細(xì)胞存活；本研究結(jié)果也顯示TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)顯著增加，LC-3I向 LC-3II轉(zhuǎn)換明顯。以上研究結(jié)果表明骨細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)正常與病理性骨代謝。同時我們還發(fā)現(xiàn)顱頂局部注射自噬特異性抑制劑3-MA能明顯促進(jìn)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷，增加骨細(xì)胞凋亡，提示自噬也參與了TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷。

綜上，TCP磨損顆粒可通過激活自噬和凋亡誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞損傷，促進(jìn)假體周骨溶解和關(guān)節(jié)無菌性松動。但是，TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞自噬是否與氧化應(yīng)激的發(fā)生有關(guān)，還需要以后進(jìn)行深入地探討。

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