李冬雪 趙曉珍 王勇 練珊珊 任亞峰 陳卓

摘 要 貴州省惠水縣茶區(qū)常發(fā)生茶輪斑病，對茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量影響較大。為確定該病害的病原菌，本文對病害葉片的病原菌進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)，通過柯赫氏法則進(jìn)行病原菌針刺法和剪切法的致病性測定。并依據(jù)病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、β-微管蛋白、延伸因子-1α進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析?；诓≡嗷蛳到y(tǒng)發(fā)育和形態(tài)學(xué)結(jié)果，將病原菌確定為茶假擬盤多毛孢（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）。

關(guān)鍵詞 茶樹；茶輪斑??；假擬盤多毛孢屬；形態(tài)特征；致病性分析；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號 S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Tea gray blight disease always takes place in the tea area of Huishui County， Guizhou Province， which severely affects the quality and yield of tea leaves. To determine the pathogen of the disease， we isolated， purified and cultivated the pathogenic fungus from the diseased tea leaves， then determined its pathogenicity following Kochs rule with the methods of needle punch and cut. Phylogenetic analyses against multi-locus sequences， viz. rDNA-ITS， β-tublin and EF-1α were conducted. Based on the morphology and phylogenetic analyses， the pathogen was identified as Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis.

Keywords Camellia sinensis； tea gray blight disease； Pseudopestalotiopsis； morphological characteristics； pathogenicity analysis； phylogenetic analysis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.022

茶輪斑?。═ea grey blight）是一種影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害，在世界各產(chǎn)茶區(qū)均有發(fā)生。1973年，該病害首次在日本鹿兒島的茶樹上發(fā)現(xiàn)，后將其命名為Zonate leaf spot[1]。茶輪斑病可危害茶樹嫩葉、成葉和嫩莖[1]。癥狀特征為同心輪紋病斑，其上散生黑色小粒點(diǎn)[1]。成葉發(fā)病后可形成大病斑，易落葉。在日本茶區(qū)，茶輪斑病可導(dǎo)致茶葉減產(chǎn)10%～20%[2]。在南印度茶區(qū)，在危害高峰期由該病害引起的減產(chǎn)可達(dá)17%[3]。茶輪斑病是我國茶樹的主要病害，普遍發(fā)生于浙江、安徽、福建、云南、貴州和海南等地[4]。

研究表明，茶輪斑病的病原菌存在2個(gè)優(yōu)勢種—茶擬盤多毛孢[Pestalotiopsis theae （Sawada） Steyaert]和P. longiseta （Speg.） K. Dai & Tak.

Kobay[5]。P. theae （Sawada） Steyaert廣泛存在于印度、中國等產(chǎn)茶國家[3， 6]；P. longiseta （Speg.） K. Dai & Tak. Kobay主要存在于日本各茶區(qū)[7-8]。2014年，茶擬盤多毛孢被劃分至假擬盤多毛孢屬（Pseudopestalotiopsis），被重新命名為Ps. theae （Sawada） Maharachch.， K.D. Hyde & Crous[9]。近年來，不斷有茶輪斑病病原菌鑒定的報(bào)道。例如，李應(yīng)祥等[10]鑒定貴州都勻茶區(qū)茶輪斑病的病原菌為P. theae。通過對病原菌rDNA-ITS、β-tubulin和EF-1α三個(gè)基因的序列測定及比對，Chen等[11]發(fā)現(xiàn)重慶茶區(qū)茶輪斑病的病原菌與山茶花擬盤多毛孢菌株P(guān). camelliae CBS 443.62和P. camelliae OP111分別有100%和99%的相似度。Zhang等[12]從云南茶輪斑病病原中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新種P. furcata。Chen等[13]通過對茶輪斑病病原鑒定，發(fā)現(xiàn)其病原為茶假擬盤多毛孢（Ps. camelliae-sinensis）、新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）和山茶花擬盤多毛孢。因此，茶輪斑病的病原菌存在多樣性，可能與地域、環(huán)境和寄主等因素相關(guān)，值得深入研究。貴州省惠水縣茶區(qū)具有高溫、高濕等氣候特點(diǎn)，茶輪斑病常年發(fā)生，且危害嚴(yán)重。本研究針對該區(qū)域的茶輪斑病病原菌進(jìn)行分離、純化，通過形態(tài)學(xué)觀察、致病性測試、以及分子生物學(xué)鑒定，確定引起該地區(qū)茶輪斑病的病原，為該病害的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離、培養(yǎng)和純化

2016年10月，在貴州省惠水縣七里沖茶區(qū)采集具有典型輪紋癥狀的茶樹葉片，采用常規(guī)組織分離法，將病健交界處的葉片組織剪成約3 mm×3 mm的小葉塊，先在75%酒精中浸3～4 s，然后5%次氯酸鈉溶液中浸泡4～5 min，最后用無菌水洗4次，并置于已滅菌的濾紙上。待水分吸干后，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株GZHS-2017-01分別接種到麥芽浸粉瓊脂（MEA）、PDA和燕麥片瓊脂（OA）培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落形態(tài)特征。用解剖針挑取少許菌絲制片，鏡下觀察病原菌的

菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢細(xì)胞及分生孢子。

1.3 致病性測試

分別采用針刺法和剪切法測試致病性[14]。將培養(yǎng)5 d后的GZHS-2017-01菌株邊緣打取直徑為5 mm的菌餅接種至福鼎大白茶的葉片上，用無菌脫脂棉吸附經(jīng)兩次滅菌的無菌水進(jìn)行保濕。將枝條插入裝有無菌水的錐形瓶，并套上保鮮袋，置于植物光照培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。接種無菌PDA的葉片作為空白對照。培養(yǎng)期間，每日沿接種處剖開觀察，并記錄癥狀變化。每個(gè)處理接種10片葉片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及病斑大小。對病葉進(jìn)行再分離，確定其與接種菌株是否一致。

1.4 分子鑒定

用手術(shù)刀片刮取在PDA上培養(yǎng)6 d的病原菌菌絲，用液氮研磨成粉末。采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（B518259-0050， 上海生工生物工程股份有限公司）提取病原菌DNA。采用rDNA-ITS、β-tub和EF-1α 基因?qū)seudopes-talo- tiopsis屬真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[15]。采用White等[16]報(bào)道的通用引物（ITS4和ITS5）進(jìn)行rDNA-ITS基因擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中已報(bào)道的β-tub（JQ683711.1）和EF-1α（JQ683743.1）基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用HS Taq酶試劑（Ex Taq Hot Start Version， 大連TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用切膠純化回收試劑盒（E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit， 美國OMEGA bio-tek公司）純化PCR產(chǎn)物；采用pGEM?-T Easy Vector System I（Promega公司， 美國）連接純化PCR產(chǎn)物至T載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（TransGen Biotech公司， 北京），挑取陽性克隆，委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果提交至Bankit，獲得基因登錄號。結(jié)合EF-1α序列NCBI-blast在線比對的結(jié)果，選擇參比序列。利用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行拼接及序列多重比對。采用PAUP v 4.0b10 （Swofford 2003）及最大簡約法（Maximum Parsimony， MP）進(jìn)行聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建，rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法選擇Bootstrap，重復(fù)次數(shù)（replication）為1 000，最大的樹數(shù)目（Maxtree）設(shè)置為10 000。小于50的自展值在發(fā)育樹上不體現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與純化

從有典型輪紋癥狀的茶樹葉片分離純化出15個(gè)菌株，其中，疑似茶假擬盤多毛孢Ps. camelliae-sinensis的菌株最多，共12個(gè)，比例約為80.0%。同時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)分離獲得的12個(gè)疑似茶假擬盤多毛孢菌株在分生孢子、菌絲和菌落形態(tài)上均一致。選擇菌株GZHS-2017-01為代表菌株進(jìn)行深入研究。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在3種培養(yǎng)基上的生長速度由快至慢依次為MEA>PDA>OA。在MEA培養(yǎng)基上，菌落呈同心圓狀，邊緣平整，背面中間部呈橙色，邊緣為淡黃色，菌絲濃密，呈白色絨狀圖（圖1-A）。PDA培養(yǎng)基上，菌落呈紋狀，邊緣稍有不規(guī)則，背面呈淡黃色，菌絲為白色或無色（圖1-B）。OA培養(yǎng)基上，菌落呈波浪狀，邊緣不規(guī)則，正面為白色，背面由中心至邊緣顏色由淺棕色漸變至白色，菌絲呈白色（圖1-C）。

產(chǎn)孢細(xì)胞在產(chǎn)孢初期較長，直立或微彎曲，細(xì)胞游離的一端略尖、中間略寬，無色（圖2-A）；中期變?yōu)槠【破繝睿休^短的附屬絲，無明顯分隔，細(xì)胞無色或者淡色（圖2-B）；后期呈紡錘形，出現(xiàn)明顯分隔，細(xì)胞著棕色，附屬絲變長（圖2-C）。分生孢子大小為（24～30） μm×（6～9） μm，紡錘形，直向略彎，具有4個(gè)隔膜5個(gè)細(xì)胞；兩端細(xì)胞細(xì)，細(xì)胞頂端有2～3根（主要有3根）無色附屬絲；少數(shù)有1或4根，長度為16～38 μm。附屬絲頂端略膨大；尾端有一根基部附屬絲，長度為2～ 11 μm。分生孢子初期無色，后期頂端細(xì)胞無色，圓柱形或錐形，長3～5.5 μm；中央3個(gè)細(xì)胞長15.5～21 μm，均變?yōu)楹稚?，顏色深淺基本相同。隔膜顏色較著色細(xì)胞顏色更深，近黑色；基部細(xì)胞透明，倒錐形，長3.5～6 μm（圖2-D～G）。

2.3 病原菌的致病性測定

茶樹葉片經(jīng)針刺法和剪切法接種菌株GZHS- 2017-01后均可產(chǎn)生病斑。接種4 d就可見較為明顯的病斑，在傷口處呈棕黃色，邊緣為淺黑色（圖3-A2、B2）。當(dāng)時(shí)間延長至14 d，2種處理的病斑都不斷擴(kuò)大（圖3-A3、B3）。比較接種不同時(shí)間的病斑，發(fā)現(xiàn)接種后第4 d如果不產(chǎn)生病斑，后期基本不產(chǎn)生病斑。提示接種早期對病原成功侵染較為關(guān)鍵，我們推測菌餅與葉片傷口貼合不好，或者菌絲活力不夠，導(dǎo)致菌絲未能成功侵染。隨后因?yàn)榧闹鲗羟谢蜥槾虃诘捻憫?yīng)反應(yīng)，在針刺或剪切部位所形成的防御效應(yīng)，菌絲就更難以侵染。

我們對針刺和剪切處理14 d的發(fā)病率和病斑大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，表明剪切處理的侵染率比針刺處理高，但后期2種處理的病斑大小差異不大（表2）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針刺法和剪切法對照無病斑產(chǎn)生（圖3-A1、B1）。

接種至茶葉上病斑初期為棕黃色，后期病斑不斷擴(kuò)展，中間變?yōu)闇\棕黃色，邊緣黑色面積擴(kuò)大，見有少數(shù)凸起的濃黑色小粒點(diǎn)，與田間癥狀類似（圖4）。進(jìn)一步對病斑中的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及分子鑒定，結(jié)果表明與接種菌一致。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

在獲得rDNA-ITS（MG744351）、β-tub（MG744352）和EF-1α（MG744353）的基因登錄號后，序列比對發(fā)現(xiàn)菌株GZHS-2017-01與Ps. camelliae-sinensis的模式菌株（LC3490）在3個(gè)基因上序列相似性非常高。我們采用3個(gè)基因（rDNA-ITS+β-tub+EF-1α）加合的方法進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析。3個(gè)基因加合總長度為1740個(gè)位點(diǎn)（rDNA-ITS： 1-498， β-tub： 499-842， EF-1α： 843-1470）。其中，簡約信息位點(diǎn)93個(gè)，可變非簡約信息位點(diǎn)164個(gè)，并采用PAUP v 4.0b10（Swofford 2003）軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。運(yùn)行結(jié)果顯示獲得1個(gè)進(jìn)化樹（TL=289， CI=0.93， RI=0.87， RC=0.81， HI=0.07）（圖5）。系統(tǒng)學(xué)的分析將GZHS-2017-01與模式菌株（LC3490）歸為一個(gè)分支（自舉支持率為81%）。

3 討論

本研究從貴州惠水茶輪斑病的病害樣品中分離獲得與GZHS-2017-01高度相似的多個(gè)菌株，根據(jù)柯赫氏法則，確認(rèn)其為茶輪斑病的致病菌?；?個(gè)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹初步確定致病菌GZHS-2017-01為茶假擬盤多毛孢（Ps. camelliae-sinensis）。

擬盤多毛孢屬真菌的傳統(tǒng)分類方法有限，主要依據(jù)于植物寄主和孢子的形態(tài)特征。隨著分子系統(tǒng)發(fā)育樹在擬盤多毛孢屬真菌分類中的應(yīng)用，Maharachchikumbura等[9]依據(jù)rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因序列對擬盤多毛孢屬的分類進(jìn)行了修訂，并從此屬中劃分出了新擬盤多毛孢和假擬盤多毛孢2個(gè)屬。假擬盤多毛孢屬進(jìn)一步劃分出Ps. camelliae、Ps. cocos、Ps. ignota、Ps. indica、Ps. kubahensis、Ps. simitheae和Ps. Theae 7個(gè)種[17]。近年來，我國廣西、浙江、云南等地茶樹上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)茶假擬盤多毛孢的危害[15]。通過比較GZHS- 2017-01與Ps. camelliae-sinensis F. Liu & L. Cai sp. nov.的形態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)二者間在菌落和分生孢子有很多相似之處。

因此，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果及形態(tài)學(xué)特征，我們確定貴州惠水茶區(qū)茶輪斑病的病原菌GZHS-2017-01為茶假擬盤多毛孢。

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