陳林濤 韋雙雙 黃永林 吳昊 郭子怡 陳銀華 王大勇

摘 要 為獲得高產(chǎn)重組人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因紫花苜?！坝慰汀保∕edicago sativa L. cv. ‘Eureka）株系用于規(guī)?；a(chǎn)rHSA，構(gòu)建了rHSA植物表達(dá)載體。以紫花苜蓿子葉愈傷組織為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選出潮霉素抗性植株，提取抗性再生紫花苜蓿植株基因組DNA做PCR鑒定，結(jié)果表明重組人血清白蛋白基因片段已整合到紫花苜?；蚪M中；提取轉(zhuǎn)基因植株總蛋白，Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明rHSA在轉(zhuǎn)基因植株中成功表達(dá)。此結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因紫花苜?？煞€(wěn)定表達(dá)rHSA。

關(guān)鍵詞 重組人血清白蛋白；紫花苜蓿；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào) Q786；R977.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Human serum albumin （HSA） is the most abundant protein in human plasma， and is widely used in clinical practice and biopharmaceutical industry. Gene-recombinant HSA （rHSA） is an ideal substitute of plasma-derived HSA at present. In order to make high-yielding transgenic Medicago sativa L. cv. ‘Eureka for industrial production of rHSA， an expression vector was constructed using a modified pCAMBIA1300 plasmid， and the expression vector constructed was transferred into the cotyledon callus of the plant by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. After selection of hygromycin-resistant plants， the genomic DNA of the regenerated transgenic plant was extracted for PCR， and the results indicated that the rHSA gene was integrated into the genome of M. sativa L. In addition， total proteins of the transgenic plants were extracted and tested by Western blotting， and the results showed that rHSA was successfully expressed in the plants. The study confirmed that rHSA could be expressed steadily in transgenic Medicago sativa L. and it laid a foundation for further study on separation and purification of rHSA from transgenic Medicago sativa L.

Key words recombinant human serum albumin； Medicago sativa L. cv. Eureka； Agrobacterium tumefaciens； transgene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.017

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中主要的蛋白質(zhì)，約占血漿總蛋白的60%。HSA的主要生理功能是維持血液膠體滲透壓、結(jié)合并運(yùn)輸內(nèi)源性及外源性物質(zhì)[1]，臨床上用于燒傷或嚴(yán)重失血等引起的休克、急性缺血性腦卒、腎病綜合征、肝硬化、肺性腦病、糖尿病性腎病和皮膚潰爛等，也可作為血漿增溶劑[2]。血漿白蛋白每下降2.5 g/L，死亡危險(xiǎn)性增加24%～56%[3]；血漿白蛋白水平<20 g/L，患者死亡率幾乎是100%[4]。在制藥領(lǐng)域，HSA廣泛用作保護(hù)劑、穩(wěn)定劑和賦形劑等。目前，HSA全球年銷售量超過600 t，與實(shí)際850 t的需求相比，約有250 t的年缺口[5]。臨床使用的HSA主要通過人體血液提取，受人血來源不足和血源傳染病的影響，供應(yīng)相對(duì)緊張[6]。因此，重組人血清白蛋白的生產(chǎn)作為一種獲得大量無病原的HSA的替代方法越來越受到重視。

在過去的幾十年里，對(duì)于rHSA的表達(dá)研究已經(jīng)涉及細(xì)菌、酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等多種表達(dá)系統(tǒng)[7]。1981年，Lawn等[8]首次實(shí)現(xiàn)了HSA基因在大腸桿菌中的表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)2.5 g/L。目前應(yīng)用最多的是酵母表達(dá)體系，日本三菱公司采用AOX2啟動(dòng)子，通過補(bǔ)料分批培養(yǎng)，使rHSA在畢赤酵母中的表達(dá)量提高到10 g/L[9]。在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，HSA的用量較大，成年人每日最低劑量可達(dá)5～10 g，現(xiàn)有微生物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)規(guī)模無法滿足需要。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的rHSA 可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，具有表達(dá)量高、生物活性好、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)體系中，已有研究表明rHSA在轉(zhuǎn)基因小鼠[10]、轉(zhuǎn)基因牛的乳腺細(xì)胞[11]以及轉(zhuǎn)基因蠶絲內(nèi)[12]均成功表達(dá)。與其他的生物反應(yīng)器相比，植物生物反應(yīng)器所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)可完整地完成轉(zhuǎn)錄后修飾、折疊等過程，能表達(dá)出具有生物活性的功能蛋白。此外，植物生物反應(yīng)器易于大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白，植物的田間種植和管理比其他系統(tǒng)更加低廉、有效，生產(chǎn)成本和管理投資等相比其他表達(dá)體系有很大的優(yōu)勢(shì)，并且不存在血源性病原體污染等風(fēng)險(xiǎn)。利用植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)rHSA的研究在轉(zhuǎn)基因煙草[13]、馬鈴薯塊莖[14]、水稻細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[15]等受體中獲得了成功。楊代常等[16]利用水稻胚乳表達(dá)的rHSA占糙米中可溶性蛋白總量的10.58%，表達(dá)量為2.75 g/kg，但是水稻本身的生產(chǎn)周期限制了 rHSA的生產(chǎn)。由于微生物發(fā)酵規(guī)模和植物生長(zhǎng)周期等的限制，以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備rHSA存在傳播疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)，到目前為止，進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)的rHSA主要來源于酵母和轉(zhuǎn)基因水稻等，其制備的rHSA主要用作培養(yǎng)基或者制劑輔料，仍然不能滿足臨床用藥需求。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一種廣泛種植的豆科多年生牧草，本身不具毒性[17]。它具有高營(yíng)養(yǎng)、適應(yīng)力強(qiáng)、適口性好等特點(diǎn)[18]，其蛋白含量一般在18%以上。此外，它的再生能力強(qiáng)，一年可以收割多次，能連續(xù)多年高產(chǎn)，是表達(dá)外源蛋白的理想受體材料[19]。近年來以紫花苜蓿作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白已取得一定進(jìn)展[20-24]。本研究構(gòu)建rHSA植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，并在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中成功表達(dá)，為利用轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿生產(chǎn)rHSA奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿選育品種“游客”（Medicago sativa L. cv. ‘Eureka），購(gòu)于百綠（天津）國(guó)際草業(yè)有限公司。

農(nóng)桿菌株GV3101、質(zhì)粒pCAMBIA1300均為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pGEM-ALB購(gòu)自上海權(quán)陽(yáng)生物科技有限公司。Dzup基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)于上海生工（產(chǎn)品編號(hào)B518203）。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ/SalⅠ購(gòu)于NEB公司。T4連接酶、DNA聚合酶購(gòu)于Takara公司。植物生長(zhǎng)激素購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。VE386半干轉(zhuǎn)移電泳槽購(gòu)自Tanon公司。Rabbit Anti-Serum albumin購(gòu)自Bioss公司，貨號(hào)bs-0945R。Goat Anti-Rabbit IgG H&L （Alexa Fluor? 647）購(gòu)自abcam公司，貨號(hào)：ab150079。

1.2 方法

1.2.1 基因重組人血清白蛋白全長(zhǎng)cDNA的克隆 根據(jù)已公布的人血清白蛋白基因CDS序列（NCBI Reference Sequence：NM_000477.5）設(shè)計(jì)HSA基因全長(zhǎng)cDNA引物，在引物兩端加上KpnⅠ/SalⅠ酶切位點(diǎn)，在5端起始密碼子前引入Kazak序列（5-GCCACC-3），引物為ALB-F（5-CGGGGTACCGCCACCATGGATGCACACAAG-3），ALB-R（5-CGCGTCGACTTATTATTATAAGCCTAAGGC-3）。

以人血清白蛋白中間質(zhì)粒pGEM-ALB為模板，用特異性引物ALB-F、ALB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并回收，得到HSA全長(zhǎng)序列。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將HSA擴(kuò)增回收產(chǎn)物和pCAMBIA1300質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切產(chǎn)物。用T4連接酶將酶切產(chǎn)物于4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α得到的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序，最終得到HSA基因序列插入質(zhì)粒pCAMBIA1300的KpnⅠ和SalⅠ位點(diǎn)之間的重組質(zhì)粒，即重組人血清白蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-HSA。HSA基因由CAMV35s啟動(dòng)子控制，至Tnos轉(zhuǎn)錄終止（圖1）。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得 采用電擊法（Bio-Rad MicroPulser電穿孔儀，型號(hào)：1652100）將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-HSA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)單菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因工程菌。將陽(yáng)性單克隆單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)用于紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化。紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化參考Liu等 [25]的方法進(jìn)行。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液與紫花苜蓿愈傷組織共培養(yǎng)后，用25 mg/L的潮霉素進(jìn)行抗性篩選，篩選得到的抗性愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)分化、生根獲得轉(zhuǎn)基因組培苗。經(jīng)煉苗后，將轉(zhuǎn)基因組培苗移至土壤中自然條件培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 取轉(zhuǎn)基因植株的葉片用液氮研磨成粉末，用Dzup基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提，提取液經(jīng)氯仿抽提、無水乙醇沉淀、75%乙醇漂洗后晾干。用無菌雙蒸水溶解沉淀得到轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，用引物ALB-F、ALB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株。對(duì)基因檢測(cè)為陽(yáng)性的植株進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，將葉片組織用液氮冷凍，每克組織中加入3 mL蛋白提取緩沖液[0.1 mol/L Tris-HCl，10 mmol/L MgCl2，18%（w/V）蔗糖，40 mmol/L β-巰基乙醇，pH 8.0]，研缽中充分研磨后用紗布過濾，離心得到的上清即為蛋白質(zhì)粗提液。樣品經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后用半干轉(zhuǎn)移電泳槽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，25 V，4 mA/cm2轉(zhuǎn)印1 h至硝酸纖維素膜上，將膜于室溫封閉2 h后放在含HSA一抗（Rabbit anti-serum albumin）的稀釋液中4 ℃孵育過夜；用TBST緩沖液洗膜3次（每次10 min）后，避光室溫孵育二抗[Goat anti-rabbit IgG H&L （Alexa Fluor? 647）] 2 h，再用TBST緩沖液洗膜3次后用Typhoon FLA 9500掃膜。Western blotting檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的即為成功表達(dá)rHSA的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSA基因 cDNA的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

以人血清白蛋白中間質(zhì)粒pGEM-ALB為模板，用特異性引物ALB-F、ALB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1 760 bp的片段（圖2）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并回收，得到HSA全長(zhǎng)序列。HSA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pCAMBIA1300質(zhì)粒分別用KpnⅠ和SalⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α得轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切檢測(cè)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到1 760 bp左右的小片段和10 000 bp左右的大片段，分別與HSA基因片段和pCAMBIA1300質(zhì)粒所作對(duì)照的條帶保持一致（圖3）。將重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該質(zhì)粒為HSA基因序列插入pCAMBIA1300質(zhì)粒的KpnⅠ和SalⅠ位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒，即rHSA植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-HSA。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿轉(zhuǎn)化

采用電擊法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-HSA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)單菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因工程菌，菌落PCR結(jié)果見圖4。

紫花苜?！坝慰汀狈N子經(jīng)2%（有效氯含量）次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，接種至1/2 MS培養(yǎng)基萌發(fā)生長(zhǎng)5 d。分離無菌子葉至愈傷組織培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的形成，繼代培養(yǎng)20～30 d后可得到淡黃色的胚性脆性愈傷組織，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織分離成直徑0.5 cm的細(xì)胞團(tuán)用于轉(zhuǎn)化。用農(nóng)桿菌重懸液（OD600=0.6）浸染愈傷組織2 min后共培養(yǎng)2～3 d，將轉(zhuǎn)染后的紫花苜蓿愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有潮霉素25 mg/L和頭孢噻肟鈉500 mg/L的篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，20 d左右大部分愈傷組織褐化死亡。將具有Hyg抗性的愈傷組織繼代培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，培養(yǎng)4～5周后愈傷組織分化形成翠綠色的胚芽，繼續(xù)培養(yǎng)至形成幼苗。誘導(dǎo)幼苗形成不定根，培養(yǎng)至形成發(fā)達(dá)根系，將無菌組培苗煉苗后移栽至室外自然條件下生長(zhǎng)，其轉(zhuǎn)化過程見圖5。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

轉(zhuǎn)化篩選獲得26株再生植株，以Dzup基因組DNA抽提試劑對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的葉片進(jìn)行基因組DNA抽提，以提取的基因組DNA為模板，用引物ALB-F、ALB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分植株對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。其中陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒pCAMBIA1300-HSA，陰性對(duì)照為野生型紫花苜蓿“游客”基因組DNA。泳道1～8獲得了與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的約為1 760 bp的條帶，確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

對(duì)部分基因檢測(cè)為陽(yáng)性的植株進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，將樣品于10% SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果見圖7。陽(yáng)性對(duì)照為血源性人血清白蛋白，陰性對(duì)照為野生型紫花苜?！坝慰汀钡鞍状痔嵛?。樣品1～7均呈陽(yáng)性，即成功表達(dá)rHSA的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株。

3 討論

1986年，Deak等[26]首次實(shí)現(xiàn)了苜蓿轉(zhuǎn)基因體系的建立，證明了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良紫花苜蓿的可行性。隨后，針對(duì)紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因的研究越來越多，除生物反應(yīng)器以外，還涉及抗非生物脅迫[27-28]、抗生物脅迫[29-30]和品質(zhì)改良[31-32]等方面。紫花苜蓿蛋白含量高，含多種礦物元素、維生素等，在農(nóng)牧業(yè)中發(fā)揮著重要的作用。紫花苜蓿作為優(yōu)質(zhì)牧草，其生物安全性有保障。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將HSA基因?qū)胱匣ㄜ俎＜?xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株?；蚪MDNA的PCR檢測(cè)和Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明rHSA在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中成功表達(dá)。到目前為止，多種rHSA表達(dá)體系的表達(dá)量都相對(duì)較低，由于生物的個(gè)體差異，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于外源蛋白的表達(dá)量會(huì)有所不同，筆者會(huì)著眼于篩選出具有高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因受體植株，以期為后續(xù)的研究打好基礎(chǔ)。

對(duì)于高效利用轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿規(guī)?；a(chǎn)rHSA，除了分子水平的優(yōu)化和改進(jìn)，還應(yīng)該注重轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的種植和管理，以便提高產(chǎn)量。紫花苜蓿分枝數(shù)和植株高度是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。王彥華等[33]研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)減少播種量可以提高植株高度。王茜等[34] 的研究表明土壤水分和施氮水平具有顯著的互作效應(yīng)。在缺水的地區(qū)或季節(jié)，施肥與灌溉應(yīng)同步進(jìn)行；在含水量較高的地區(qū)，適當(dāng)增施氮肥有利于紫花苜蓿高產(chǎn)。紫花苜蓿一年可刈割多次，刈割時(shí)留茬高度對(duì)苜蓿的再生和產(chǎn)量有顯著影響。王坤龍等[35]通過測(cè)定不同留茬高度對(duì)苜蓿根系生長(zhǎng)、儲(chǔ)藏性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和返青率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著留茬高度的增加，主根直徑、根干重和側(cè)根總數(shù)均增加。所以，適當(dāng)?shù)卦黾恿舨绺叨瓤梢蕴岣哕俎５漠a(chǎn)量及返青率，從而提高rHSA的利用率。此外，王偉等[36]的研究表明種植年限對(duì)紫花苜蓿的生產(chǎn)力和品質(zhì)均有影響。隨著種植年限的增加，株高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，為了最大限度地提高rHSA的產(chǎn)量，應(yīng)該把握好轉(zhuǎn)基因植株的種植利用年限。

相比臨床劑量為納克或微克數(shù)量級(jí)的細(xì)胞因子、激素等蛋白質(zhì)藥物來講，生產(chǎn)HSA的純度要求更高，純化物中即使含有0.001% 的雜質(zhì)，也會(huì)給患者造成很大危害，所以基因重組人血清白蛋白的分離純化是后續(xù)研究的關(guān)鍵。宿主自身的蛋白質(zhì)和rHSA的分離是難題之一。目前，紫花苜蓿蛋白的提取方法有酸堿凝聚法、酸堿加熱法、鹽析法、有機(jī)溶劑法和超濾法等。不同的提取方法，以及對(duì)樣品的處理方式、處理程度的不同，都會(huì)影響提取的質(zhì)量[37]。從轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中分離純化出rHSA應(yīng)該結(jié)合rHSA與苜蓿本身所含蛋白質(zhì)的區(qū)別，探索最佳的工藝條件，包括提取溫度、pH值等，在保證有效的蛋白質(zhì)得率前提下降低生產(chǎn)成本。雖然目前酵母表達(dá)體系和植物生物反應(yīng)器在rHSA的生產(chǎn)中取得了突破，實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)，但是基于全球HSA的來源短缺及價(jià)格問題，對(duì)于獲得較高表達(dá)量且能穩(wěn)定表達(dá)rHSA的高效生物反應(yīng)器還需進(jìn)一步深入研究。

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