程玥晴 聶銘 陳霞 江滔 謝永紅

摘? ?要? ?以小麥秸稈纖維素為主要原料，在纖維素分解過程中，通過繼代轉(zhuǎn)接，篩選和馴化了一組高效而穩(wěn)定的纖維素高效腐解菌系CMS-3。篩選出的復(fù)合菌系在50 ℃，靜止培養(yǎng)條件下，在第7天可使未經(jīng)任何處理的麥秸的分解率達(dá)到73%，其中纖維素、半纖維素的分解率分別為67%、75%，而對木質(zhì)素的分解能力很低。復(fù)合菌系CMS-3經(jīng)過多次繼代篩選和培養(yǎng)，菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩(wěn)定性。復(fù)合菌系CMS-3中的菌種主要由隸屬于芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成，菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞? ?秸稈纖維素;分解特性;高效腐解菌系;CMS-3

中圖分類號：Q946;S182? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.007

目前已有很多關(guān)于纖維素分解菌的報(bào)道，大部分都是以純培養(yǎng)方法獲得的，但單一菌株對天然纖維質(zhì)成分的農(nóng)業(yè)廢棄物的分解能力很有限，近年來的一些研究表明，混合菌群對天然纖維質(zhì)的分解能力明顯高于單一菌株。本課題組在以小麥秸稈為主要原料的分解過程中，在不破壞微生物之間協(xié)同關(guān)系的條件下，篩選和馴化了一組高效而穩(wěn)定的纖維素高效腐解菌系CMS-3，系統(tǒng)研究了該菌群的纖維素分解特性和穩(wěn)定性，以及微生物種類構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：蛋白胨纖維素培養(yǎng)液（PCS），其成分為0.5%蛋白胨、0.5%麥稈粉、0.5%NaCl、0.2%CaCO3、0.1%酵母粉，在50 ℃靜止培養(yǎng)，溶解氧DO值為0.02～0.40。

1.2 纖維素分解菌復(fù)合系CMS-3的篩選及馴化

分別用“麥秸+豬糞”“麥秸+雞糞”“麥秸+牛糞”混合成C/N為25，含水量為65%的基質(zhì)后堆積發(fā)酵。堆肥采用條垛翻堆系統(tǒng)，翻堆頻率為每周2次，在堆肥CO2排放速率和凈重減少率最大時(shí)間段取樣。分別從各堆體取20 g樣接種于100 mL PCS中，50 ℃靜止培養(yǎng);待浸在培養(yǎng)液中的麥秸呈糊狀開始分解斷裂時(shí)，轉(zhuǎn)接于同樣的新鮮培養(yǎng)液中。如此分別轉(zhuǎn)接數(shù)代后，將pH檢測反應(yīng)偏酸和偏堿的培養(yǎng)物混合接種，在傳代過程中篩選出麥秸分解速度快而且pH保持穩(wěn)定的復(fù)合體，最終馴化成高效且穩(wěn)定的復(fù)合系CMS-3。

1.3 纖維素分解活性的測定

1）CMC糖化法。將培養(yǎng)液直接以3 000 r·min-1離心15 min后提取粗酶液。酶促反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為5 min，DNS顯色反應(yīng)時(shí)間5 min，測定波長為490 nm。

2）減重法。將1 g的濾紙作為唯一碳源配制100 mL PCS，接種10 mL CMS-3菌液，50 ℃靜止培養(yǎng)72 h后，5 000 r·min-1離心，倒上清液，用鹽酸和硝酸的混合液沖洗以消除菌體，離心，清水洗，再離心，最后105 ℃烘干后稱重，計(jì)算失重量和失重率。

1.4 CMS-3對不同纖維素材料的分解能力

分別取1 g的濾紙、未經(jīng)處理的麥稈和鋸末作為唯一碳源，配制200 mL PCS，接種10 mL CMS-3菌液，50 ℃靜止培養(yǎng)72 h后，用失重法測定分解能力。

1.5 連續(xù)培養(yǎng)條件下CMS-3發(fā)酵液的pH和纖維素分解能力的穩(wěn)定性

在2 000 mL三角瓶中裝1 500 mL PCS，每瓶加3 g麥秸，不調(diào)pH值。分2組：一組不再供應(yīng)新的麥秸，在50 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，每天測定1次培養(yǎng)液的pH值;另一組在第1次供應(yīng)的麥秸大部分分解時(shí)開始每天追加1.5 g麥秸，每天測定1次pH值，并觀察麥秸的分解情況。

1.6 麥秸殘留中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測定

取1 g小麥秸稈作為唯一碳源，配制190 mL PCS，接種10 mL CMS-3菌液，50 ℃靜止培養(yǎng)20 d。共設(shè)20個(gè)重復(fù)，分別在第0， 7， 15， 20天取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)重復(fù)樣品。將烘干后的秸稈殘?jiān)鬯?，過1 mm的篩子，稱取0.2～0.5 g裝入濾袋，3個(gè)重復(fù)，采用范式洗滌法[1]測定秸稈的可溶性物質(zhì)、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。

1.7 發(fā)酵液中可溶性糖的測定

蒽酮比色法，設(shè)3次重復(fù)。

1.8 復(fù)合菌系CMS-3種類組成分析

取復(fù)合菌系CMS-3對麥秸不同發(fā)酵天數(shù)（3， 7， 10， 15， 20 d）的發(fā)酵液。用氯苯法提取每個(gè)處理樣品的總DNA，用變性梯度膠電泳（DGGE）法比較不同發(fā)酵天數(shù)的16S rDNA條帶，分析菌種構(gòu)成。用于DGGE分析的PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rDNA的V3區(qū)。所采用的引物為細(xì)菌通用引物對357F-GC5′-CGCCCG-CCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，前10個(gè)循環(huán)：93 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;接下來10個(gè)循環(huán)：93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;最后10個(gè)循環(huán)：93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;產(chǎn)物最終72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖膠檢測。DGGE回收條帶檢測所用PCR引物為357F和517R，退火溫度為50 ℃，循環(huán)數(shù)為25，其余同上。PCR產(chǎn)物用于DGGE分析。從雙變性梯度凝膠上回收16S rDNA的V3區(qū)條帶，再擴(kuò)增、濃縮后進(jìn)行堿基序列分析，擴(kuò)增引物為357F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCG-GCTGCTGG-3′）。登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，對堿基序列進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)親緣關(guān)系進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMS-3的篩選與馴化

3種堆肥樣品中均得到有較強(qiáng)纖維素分解能力的培養(yǎng)物。其中，“麥秸+牛糞”（編號為A）的培養(yǎng)物麥秸分解速度最快，經(jīng)168 h后相當(dāng)于培養(yǎng)物1.0%的麥秸大部分被分解，其后依次為“麥秸+豬糞”（B）、“麥秸+雞糞（C）”的培養(yǎng)物（見表1）。但隨著傳代次數(shù)的增加，它們的纖維素分解速度變慢，發(fā)酵液的pH值也不穩(wěn)定，在三種堆肥樣品培養(yǎng)物中B和C發(fā)酵液逐漸趨于微酸性，A發(fā)酵液逐漸趨于微堿性，最終停止反應(yīng)。將A， B， C三種發(fā)酵液互相混合接種，得到1組麥秸分解速度144 h的混合體。經(jīng)多次的傳代、馴化，混合體在發(fā)酵過程中的pH值已穩(wěn)定在6.5左右，并在2 L的培養(yǎng)規(guī)模上連續(xù)投放麥秸的情況下分解活性保持1個(gè)月以上。此混合體即為含多種纖維素分解菌的高效而穩(wěn)定的纖維素分解菌復(fù)合系（編號為CMS-3）。

2.2 CMS-3分解麥秸的纖維素酶活性及分解率

在含有1 g濾紙的200 mL PCS中，接CMS-3菌液10 mL，50 ℃靜止培養(yǎng)，第48， 72， 96 h用CMC糖化力法分別測定纖維素酶活。結(jié)果酶活性分別為101.8±2.6， 97.5±1.4， 90.2±0.5 U·mL-1，第48 h的活性最高。在實(shí)際觀察時(shí)，第48 h紙片變膨松，第72 h紙片大部分區(qū)域崩解，第96 h已完全崩解，說明最高的酶活性出現(xiàn)在外觀上紙片變膨松的初期。第96 h用失重法測定結(jié)果，1 g濾紙失重0.83 g，分解率為83%。失重法能比較真實(shí)地反映該復(fù)合系的纖維分解能力。

2.3 CMS-3對不同纖維素材料分解能力的比較

用失重法測定CMS-3對濾紙、麥稈粉及鋸末的分解率。其中，對濾紙的分解率最高，在96 h內(nèi)200 mL培養(yǎng)液中1 g濾紙幾乎全部被分解，分解率為（90±0.3）%;對麥秸、鋸末的分解率分別為（73±0.2）%、（12±0.4）%。由此可見，CMS-3對含較純木質(zhì)纖維素的濾紙有很強(qiáng)的分解能力，對結(jié)構(gòu)復(fù)雜木質(zhì)纖維素的麥秸也有較強(qiáng)的分解能力，而對木質(zhì)素含量較高的鋸末分解能力很有限。

2.4 在連續(xù)培養(yǎng)條件下CMS-3發(fā)酵液pH和對纖維素分解能力的穩(wěn)定性

未調(diào)pH的2瓶PCS培養(yǎng)液（A和B瓶）滅菌后的pH值為8.2和8.1。接種CMS-3培養(yǎng)48 h后，兩者的pH值下降到6.3和6.4，在48～96 h維持同樣pH并將3 g麥秸大部分分解;隨后，A瓶的pH值就上升，到第7天穩(wěn)定在8.2左右（見圖1），此水平能維持30 d。B瓶在麥秸大部分被分解時(shí)（第7天）開始每天連續(xù)投放1.5 g麥秸，結(jié)果前20 d不僅投放的麥秸大部分分解，其pH值還一直穩(wěn)定在6.2～6.4。這說明CMS-3的生長和纖維素分解功能相當(dāng)穩(wěn)定。

2.5 CMS-3分解麥秸過程中可溶性物質(zhì)、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量

CMS-3分解麥秸過程中可溶性物質(zhì)、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量見圖2。可以看出，CMS-3對小麥秸稈具有較強(qiáng)的分解能力，在第7天時(shí)，纖維素、半纖維素的分解率達(dá)67%和75%，木質(zhì)素的分解率僅為5.4%;在第15天和20天，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解率均略有降低。由此可知，CMS-3對小麥秸稈在第7天可完成大部分的分解，且主要分解半纖維素、纖維素，而對木質(zhì)素的分解能力很低。

2.6 CMS-3分解麥秸過程中可溶性糖的含量

CMS-3分解麥秸過程中，0， 7， 15， 20 d可溶性糖的含量分別為0.16±0.04， 0.07±0.005， 0.055±0.004， 0.050±0.003 mg·mL-1?？梢?，培養(yǎng)體系的可溶性糖從開始的較高水平一直下降，且在第7天時(shí)可溶性糖的下降幅度最大，秸稈分解率與分解體系的可溶性糖的積累量呈負(fù)相關(guān)。

2.7 復(fù)合菌系CMS-3種類的組成

復(fù)合菌系CMS-3在分解麥秸過程中各時(shí)間點(diǎn)的16S rDNA條帶PCR的變性梯度膠電泳（DGGE）結(jié)果見圖3，菌系種類組成見表2。由圖3可知，不同時(shí)間點(diǎn)的DGGE主要條帶變化不大，這說明該復(fù)合菌系在分解麥秸過程中菌種組成穩(wěn)定。由表2可知，該復(fù)合菌系有好氧的芽孢桿菌屬、厭氧的梭菌屬和瘤胃桿菌屬。已有研究表明，這幾類菌種都與纖維素的分解有關(guān)，其中梭菌屬能牢牢地沾附在秸稈上，且能利用纖維二糖、木糖、葡萄糖和蔗糖產(chǎn)生乙酸、乳酸和H2。復(fù)合菌系CMS-3具有強(qiáng)分解麥秸的能力可能是上述幾類菌種協(xié)同作用的結(jié)果，其協(xié)同機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

從三種堆肥樣品中篩選出的復(fù)合菌系CMS-3在50 ℃，靜止培養(yǎng)條件下，在第7天可使未經(jīng)任何處理的麥秸的分解率達(dá)到73%，其中纖維素、半纖維素的分解率分別為67%、75%，而對木質(zhì)素的分解能力很低。與已有研究結(jié)果相比，該復(fù)合菌系的分解能力處于較高水平。

復(fù)合菌系CMS-3經(jīng)過多次繼代篩選和培養(yǎng)，菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩(wěn)定性。復(fù)合菌系CMS-3中的菌種主要由隸屬于芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成，其較強(qiáng)的麥秸分解能力可能是這幾類菌種的協(xié)同作用的結(jié)果。

復(fù)合菌系CMS-3作為農(nóng)業(yè)纖維質(zhì)固體廢棄物的高效腐解菌，在農(nóng)業(yè)廢棄物處理利用中具有廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] 戴曉虎，于春曉，李寧，等.有機(jī)負(fù)荷對醋糟厭氧消化系統(tǒng)啟動的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2017，38（3）：1144-1150.