王會全 吳少華 余志雄

摘要 ?{目的]以PMI為選擇標記基因對雪柑的遺傳轉化體系進行優(yōu)化。{方法]對農桿菌的菌液濃度、實生苗培養(yǎng)條件、甘露糖篩選壓、2，4-D濃度、2，4-D預處理時間、農桿菌侵染時間、共培養(yǎng)時間進行梯度試驗來研究轉化后的再生率，并對篩選培養(yǎng)基中6-BA和NAA不同濃度組合進行試驗來研究抗性大苗的篩選。{結果]經過暗培養(yǎng)20d光培養(yǎng)10d條件的實生苗外植體在農桿菌菌液OD600為0.6，1.0mg/L2，4-D預處理3h，農桿菌侵染30min，共培養(yǎng)時間4d，篩選壓為甘露糖20g/L的情況下轉化后的再生率大大提高，而在篩選培養(yǎng)基中加入2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA有助于抗性大苗的篩選。{結論]通過對影響轉化的各種因素的優(yōu)化試驗建立了雪柑以PMI基因/甘露糖選擇標記系統的高效遺傳轉化體系。

關鍵詞 ??柑橘;6-磷酸甘露糖異構酶;遺傳轉化

中圖分類號S??188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）36-0083-07

柑橘（CitrusL.）是當今世界種植面積最大的果樹，也是我國南方重要的經濟果樹。但柑橘作為多年生木本果樹，由于童期長、遺傳高度雜合性和多胚現象，柑橘育種工作困難重重。不同品種間會有6～20年的漫長童期{1]，這使得常規(guī)育種周期變得很長。柑橘轉基因技術在過去的十多年中取得了長足的進展，為柑橘育種開辟了一條新途徑。在柑橘基因轉化研究中，大多采用上胚軸、子葉、試管苗葉片、莖段等未度過童期的組織作為基因轉化受體，由此得到的轉基因植株同樣具有童期長的缺點，且轉基因植株的園藝與商品性狀評價往往需要很長時間。因此，縮短童期是育種工作者的重要目標之一。

目前，轉基因作物的安全性問題受到極大關注。利用遺傳轉化技術改良柑橘品種首先要考慮生物安全性問題，其中主要是選擇標記基因的使用。使用安全的選擇標記基因也是最有效的方法，這些標記基因與常規(guī)標記基因不同，沒有抗生素或除草劑抗性，相對來說對生物和環(huán)境是安全的。因此，安全的選擇標記基因在今后的轉基因研究中將具有重要的戰(zhàn)略意義。筆者以福建傳統優(yōu)良甜橙品種雪柑（C.sinensisL.Osb.）為材料，在初步建立以PMI（Phosphomannoseisomerase，磷酸甘露糖異構酶）基因為選擇標記轉基因體系的基礎上{2]，進一步優(yōu)化轉化體系，建立雪柑轉基因技術平臺，為雪柑的遺傳改良、基因功能研究等奠定基礎，并為其他柑橘種類轉基因研究中利用這一安全的選擇標記系統提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。從新鮮成熟雪柑果實中取出種子，選取粒大飽滿的完好種子，在無菌條件下于70%乙醇中浸泡30s，再用0.1%升汞消毒8min，用無菌水清洗5～6次，剝去外種皮，劃破內種皮，接種于實生苗培養(yǎng)基上，在16h/d（光/暗）周期下，光照度為1500lx，（25±2）℃培養(yǎng)。取暗培養(yǎng)10d、光照20d左右的上胚軸為材料，縱切法切取1cm左右上胚軸為轉化材料，每次轉化所用的雪柑上胚軸約90個。

1.1.2菌株及質粒。根癌農桿菌EHA105、雙元載體質粒pC1301-PMI-LFY均由福建農林大學園藝學院遺傳育種實驗室提供，載體結構如圖1所示。

1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件?；九囵B(yǎng)基：MS;實生苗培養(yǎng)基：1/2MS+蔗糖15g/L;共培養(yǎng)培養(yǎng)基CM：MS+蔗糖30g/L;篩選培養(yǎng)基SMS：MS+BA2mg/L+20g/L甘露糖+Carb250mg/L。

所用培養(yǎng)基均添加7g/L瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂粉。用1mol/LNaOH調節(jié)pH至5.8，121℃滅菌20min。光照培養(yǎng)的光照時間為16h/d，光照強度為1500lx，溫度（25±2）℃。

1.2方法

1.2.1E/pC1301-PMI-LFY農桿菌侵染液的準備。將超低溫保存的工程菌液接種在加有100mg/LKan和100mg/LStr的YEB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28℃活化36h左右，挑單菌落于YEB液體培養(yǎng)基（Kan、Str100mg/L）中220r/min搖床過夜培養(yǎng)，OD600為0.6左右。取菌液分裝于已滅菌的50mLEppendorf管中，5000r/min離心20min，去上清液，用等體積MS液體培養(yǎng)基重懸，220r/min搖床適應性培養(yǎng)2h后，再離心、等體積MS重懸，稀釋測其OD600。

1.2.2轉化的基本程序。

①取暗培養(yǎng)10d光照培養(yǎng)20d左右無菌雪柑實生苗的上胚軸為外植體。

②將上胚軸橫切成1cm左右小段，再用手術刀縱切一分為二，置于盛有2，4-D0.5mg/L的無菌三角瓶中，浸泡2h。

③預處理后，將制備好的農桿菌侵染液（OD600為0.4左右）倒入無菌三角瓶中，搖動三角瓶使菌液與外植體充分接觸，侵染20min，期間輕微振蕩。

④用濾紙吸干上胚軸上的菌液，縱切切口水平朝上放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基CM：MS+蔗糖30g/L+2，4-D0.5mg/L中，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)3d。

⑤將共培養(yǎng)后的上胚軸用含250mg/L羧芐青霉素的無菌水洗5～6次，放置在無菌濾紙上吸干水分，轉入附加250mg/L羧芐青霉素的誘導篩選培養(yǎng)基SMS：MS+BA2mg/L+20g/L甘露糖+Carb250mg/L中，光下培養(yǎng)。

1.3遺傳轉化條件的優(yōu)化

對影響轉化率的各個因素進行優(yōu)化，在單個參數優(yōu)化試驗中，如無特殊說明，按照以上轉化基本程序進行，光下培養(yǎng)30d后統計分化率和大苗分化率，篩選單因素的最優(yōu)梯度。

1.3.1農桿菌菌液不同OD600值對轉化的影響。農桿菌侵染液OD600梯度值分別為0.1、0.4、0.6，農桿菌侵染后接種于培養(yǎng)皿中，每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，光下培養(yǎng)30d后統計數據。

1.3.2不同甘露糖篩選壓對轉化的影響。在篩選培養(yǎng)基SMS中，甘露糖（M）/蔗糖（S）濃度梯度設置為30/0、20/0、20/10、25/5、15/5（g/L），每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，觀察甘露糖篩選壓對轉化的影響。

1.3.3雪柑無菌實生苗不同培養(yǎng)條件對轉化的影響。分別取完全暗培養(yǎng)30d、暗培養(yǎng)10d光照20d、暗培養(yǎng)20d光照10d、完全光照30d的雪柑上胚軸進行轉化，每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，觀察實生苗不同培養(yǎng)條件對轉化的影響。

1.3.4不同侵染時間對轉化的影響。農桿菌侵染外植體時間梯度設置為20、30、40min，每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，觀察侵染時間對轉化的影響。

1.3.5不同共培養(yǎng)時間對轉化的影響。外植體經農桿菌侵染后接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基CM中，共培養(yǎng)時間梯度為2、3、4、5d，每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，觀察共培養(yǎng)時間對轉化的影響。

1.3.6預處理時2，4-D濃度對轉化的影響。在農桿菌侵染前將外植體放入附加不同濃度2，4-D的MS液體培養(yǎng)基中浸泡3h，濃度梯度為0.5、1.0mg/L，每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，比較不同濃度2，4-D預處理對轉化的影響。同時，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基添加相應濃度2，4-D。

1.3.72，4-D預處理時間對轉化的影響。2，4-D預處理時間梯度設置為0、2、3、12、24h。前3個處理用加入2，4-D的MS液體培養(yǎng)基浸泡，后2個處理用加入2，4-D的MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復。同時，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加相應濃度的2，4-D。

1.3.8篩選培養(yǎng)基SMS中不同生長調節(jié)劑對轉化的影響。共培養(yǎng)后，在SMS培養(yǎng)基中分別加入BA2mg/L、BA3mg/L、BA2mg/L+NAA0.5mg/L、BA1mg/L+NAA0.5mg/L、ZT2mg/L+NAA0.5mg/L、ZT1mg/L+NAA0.5mg/L，每個處理接種30個外植體，每個處理3個重復，30d后觀察生長調節(jié)劑對轉化的影響。

2結果與分析

2.1不同OD600值對轉化的影響

植物外植體進行農桿菌侵染時，菌液濃度對轉化頻率影響較大。菌液濃度過高會導致共培養(yǎng)時農桿菌過度生長，造成外植體褐化死亡;菌液濃度過低，則不能使足夠的農桿菌附著在外植體的傷口處，導致轉化效率嚴重下降{3]。

從表1可以看出，OD600為0.6時，抗性外植體和大苗分化率遠遠高于其他2個梯度，在共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)時沒有發(fā)現農桿菌的過度生長。在OD600為0.1和0.4的情況下，分化率差異不顯著（P>0.01）。因此，在進行雪柑外植體轉化時較適合菌液濃度的OD600為0.6（圖2）。

2.2不同甘露糖篩選壓對轉化的影響

在以PMI基因為選擇標記的遺傳轉化體系中，必須以甘露糖作為篩選劑。而雪柑上胚軸不定芽的誘導不能以甘露糖作為碳源{2]，所以在SMS中設置了甘露糖和蔗糖的不同濃度梯度。從表2可以看出，在SMS培養(yǎng)基中加入不同濃度的蔗糖后，抗性外植體的分化率會比單純加入甘露糖的培養(yǎng)基分化率要高，但這樣也同時增加了假陽性芽苗的比例。在20g/L甘露糖+10g/L蔗糖和25g/L甘露糖+5g/L蔗糖2個濃度梯度時，外植體縱切面上出現大量的愈傷組織，隨后在愈傷組織的表面形成芽，不過這些芽大多都有玻璃化現象;這些玻璃化的芽在以后的壯苗篩選中會黃化死亡，很難生長為健壯單株。而在SMS培養(yǎng)基中單純加入30g/L甘露糖，比單純加入20g/L甘露糖時抗性外植體的分化率有明顯降低，這樣就減少了對陽性芽苗的篩選力度。所以在雪柑上胚軸轉化時，篩選培養(yǎng)基SMS中適合的甘露糖濃度為20g/L（圖3）。

注：鄧肯氏新復極差測驗，不同字母表示差異達極顯著水平（P=0.01）

Note：Differentlettersmeansignificantlydifferentatthe0.01levelbyDuncansmultiplerangetest

2.3雪柑無菌實生苗培養(yǎng)條件對轉化的影響

外植體的培養(yǎng)條件對轉化也有影響。根據徐海峰{2]得出的結論：外植體的培養(yǎng)條件對雪柑不定芽的誘導存在影響，30d的雪柑上胚軸不定芽分化效率最高。由表3可知，暗培養(yǎng)20d后再光培養(yǎng)10d的上胚軸抗性外植體的分化率為86.9%，大苗分化率為14.3%，效果最好;完全光培養(yǎng)30d的上胚軸抗性外植體分化率和大苗分化率分別為17.6%和0，效果最差;暗培養(yǎng)10d光照20d和完全暗培養(yǎng)30d的上胚軸抗性外植體分化率和大苗分化率差異不顯著（P>0.01）。因此，以暗培養(yǎng)20d光照10d的上胚軸作為外植體進行農桿菌轉化效果最好（圖4）。

2.4不同侵染時間對轉化的影響

用農桿菌對植物外植體進行侵染時，在一定的菌液濃度下，侵染時間是一個關鍵因素，時間不夠附著在外植體上的農桿菌細胞不夠數量，難以達到好的轉化效果;而侵染時間過長又會引起植物外植體嚴重的農桿菌污染，即使加入高濃度的抑菌抗生素也是無法控制的。由表4可知，侵染30min的分化率明顯比20min的高，達57.2%;當侵染時間達40min時，共培養(yǎng)2d時即出現農桿菌污染，無法控制，近1/4外植體由于農桿菌生長過度而軟腐黃化，這種現象在侵染20、30min的處理中沒有出現。因此，雪柑外植體用農桿菌進行侵染的最佳時間是30min。

2.5不同共培養(yǎng)時間對轉化的影響

農桿菌對植物外植體進行侵染時，必須在傷口部位存活16h以上，才能進行T-DNA的轉移，此期間涉及農桿菌向受傷部位的附著、Vir區(qū)基因的誘導活化及T-DNA的轉移整合{3]。在黑暗中共培養(yǎng)適當的時間能提高不定芽的再生效率和轉化效率，對共培養(yǎng)時間的優(yōu)化結果如表5所示：共培養(yǎng)2d的抗性芽分化率只有5.3%，其原因為培養(yǎng)時間過短，阻礙了T-DNA的有效轉移;共培養(yǎng)3d的分化率為21.6%;共培養(yǎng)4d的分化率最高達45.1%;而共培養(yǎng)5d時外植體出現大量的褐化死亡，其原因是農桿菌過度生長所致。從這個結果來看，共培養(yǎng)時間4d是最佳的。

2.6不同2，4-D濃度預培養(yǎng)對轉化的影響

研究表明，2，4-D在雪柑遺傳轉化中會不同程度地提高轉化效率，而濃度過高會促進愈傷組織的形成，降低抗性外植體的分化效率{4]。故用添加2個濃度的2，4-D的MS液體培養(yǎng)基對外植體進行浸泡預處理3h，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入相應濃度的2，4-D。由表6可知，1.0mg/L2，4-D處理后抗性外植體的分化率高達58.2%，而0.5mg/L2，4-D處理的分化率只有22.5%。所以選用1.0mg/L的2，4-D對雪柑上胚軸進行預處理轉化效果最好。

2.7不同預處理時間對轉化的影響

在預培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入2，4-D起到了活化細胞、促進T-DNA轉移的作用，但是預培養(yǎng)時間的長短對雪柑上胚軸的轉化同樣具有重要的影響。該試驗在預處理培養(yǎng)基中加入1.0mg/L2，4-D，同時在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入1.0mg/L2，4-D。從表7可以看出，預處理3h時抗性外植體分化率最高達62.7%;在3h之前隨著時間的增長，抗性外植體分化率逐漸增高;而經過長時間預處理時，抗性外植體分化率緩慢下降。這說明，長時間在無生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，阻礙了細胞的進一步分裂生長，加快了細胞的老化，從而使農桿菌侵染效率下降;而適度的預處理則促進了細胞快速分裂，從而有助于轉化效率提高。

2.8篩選培養(yǎng)基SMS中添加不同生長調節(jié)劑對轉化的影響

從表8可以看出，2mg/LBA+0.5mg/LNAA組合的抗性外植體分化率最高達46.6%，大苗分化率也是最高達132%。鄧肯氏新復極差測驗結果表明，2mg/LBA+0.5mg/LNAA與其他濃度組合對轉化效率的影響差異不顯著。這說明在篩選培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑的不同濃度組合不是轉化效率的主要影響因素，但是不同組合對抗性芽的篩選有影響。所以在該試驗中，SMS中的生長調節(jié)劑組合為2mg/LBA+0.5mg/LNAA。

3討論

筆者通過對影響轉化的各種因素的優(yōu)化試驗建立了雪柑PMI基因/甘露糖選擇標記系統的高效遺傳轉化體系。試驗結果表明，在菌液OD600為0.6，1mg/L2，4-D預處理3h，農桿菌侵染30min，共培養(yǎng)4d，篩選壓為甘露糖20g/L的情況下大大提高了轉化后的再生率，而在篩選培養(yǎng)基中加入2mg/LBA+0.5mg/LNAA有助于抗性大苗的篩選，為以后的PMI基因/甘露糖選擇標記系統的研究提供了可靠的依據。

3.1農桿菌侵染用工程菌液的制備與OD600的選擇

在柑橘的遺傳轉化研究中，常用的農桿菌菌株主要有LBA4404、A518、EHA105、EHA101和C58，由于它們的染色體背景和所含質粒不同，所采用的柑橘材料也不同，各菌株的轉化效率差異顯著{5]。該試驗中使用的農桿菌菌株為EHA105，農桿菌的工程菌液和適當的OD600都在遺傳轉化體系中起到至關重要的作用。農桿菌長期在-80℃中保存容易造成質粒丟失，從而影響轉化效率，所以在轉化前要使用新培養(yǎng)的工程菌液，這樣可以保證質粒的完整性，而用MS液體培養(yǎng)基將離心的菌體重懸后適應性培養(yǎng)的時間不能過短，這個過程是一個讓農桿菌適應MS培養(yǎng)基和活化細菌的重要環(huán)節(jié)。而適當的OD600對轉化的影響意義更大。植物外植體進行農桿菌侵染時，菌液濃度過高會導致共培養(yǎng)時農桿菌過度生長，造成外植體褐化死亡;菌液濃度過低則不能使足夠的農桿菌附著在外植體的傷口處，導致轉化效率嚴重下降。在農桿菌侵染外植體時的試驗操作方面，要考慮到農桿菌與受體細胞的互作，二者充分接觸，使農桿菌能夠穩(wěn)定附著在受體細胞上{2]。外植體上胚軸在農桿菌菌液中是懸浮的，必須隔幾分鐘輕微搖動三角瓶使侵染混合體系中每個外植體都能浸沒到菌液中與之充分接觸，力度也不能太大，否則農桿菌難以附著在外植體細胞上。侵染混合體系比例合適，50mL的三角瓶裝工程菌液30mL，外植體數90個左右，過多或過少都影響轉化效率，過多了農桿菌無法充分接觸外植體細胞，過少了外植體往往附著農桿菌太多，共培養(yǎng)時農桿菌容易過度生長導致外植體死亡。

3.2甘露糖作為篩選劑在PMI選擇系統中的應用甘露糖是一種正篩選底物，本身不會對植物組織造成傷害，但是非轉化細胞不能利用甘露糖，而在PMI的作用下可以將6-磷酸甘露糖轉化為6-磷酸果糖，6-磷酸果糖可以進入糖酵解途徑為植物所應用，這就是甘露糖作為篩選底物的原理{6]。如同抗生素濃度過高會造成轉化細胞的生長受到強烈抑制一樣，只加甘露糖不加蔗糖也會造成大量轉化細胞極度饑餓，而一定濃度的蔗糖可以緩解這種負面影響{2]。甜菜轉化時，在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖，在甘露糖濃度達2.5～3.0g/L時，苗再生完全被抑制，但獲得最佳轉化率的甘露糖篩選濃度卻在1.25g/L左右，有20%～30%的外植體誘導出再生苗{7];轉化玉米時篩選培養(yǎng)基中碳源最佳組合為5g/L蔗糖+10g/L甘露糖{8];轉化水稻時采用30g/L甘露糖篩選壓不變，而將蔗糖含量由30g/L逐漸遞減至5g/L，可以得到理想的轉化效果{9];轉化辣椒時篩選培養(yǎng)基中碳源組合為20g/L蔗糖+15g/L甘露糖{10]。該試驗參照徐海峰{2]在建立雪柑轉化體系時的甘露糖濃度，按一定的梯度試驗尋找合適的篩選壓，發(fā)現在有蔗糖的篩選培養(yǎng)基SMS中，抗性芽的比例都會比較高，但外植體上長出了大量的叢生芽，多為假陽性植株，這為以后的篩選增加了難度。在轉基因植株的繼代篩選中，可適當地加入蔗糖加快抗性芽的生長，加快篩選進度。

3.3共培養(yǎng)在轉化中的作用

外植體與農桿菌接種后的共培養(yǎng)在整個轉化過程中是一個非常重要的環(huán)節(jié)。農桿菌的附著及T-DNA的切割、轉移和整合都是在共培養(yǎng)期間完成。所以，共培養(yǎng)技術條件的掌握是成功轉化的關鍵因素之一。共培養(yǎng)時間對轉化效率有很大影響，不同轉化材料或不同菌株類型所需的最佳共培養(yǎng)時間不同。農桿菌接種到外植體上后不能立即轉化，只有在創(chuàng)傷部位生存16h后才能把T-DNA轉移到植物細胞內{3]，因此共培養(yǎng)時間必須長于16h。共培養(yǎng)時間過短，農桿菌尚未附著，T-DNA還沒有充分切割、轉移和整合;時間過長，植物細胞易受毒害，后續(xù)培養(yǎng)時難以除菌，農桿菌容易過度生長。根據試驗確定在該系統中最佳的共培養(yǎng)時間為4d，超過時間，外植體大量的褐化死亡，農桿菌過度生長。在很多研究中，為了防止共培養(yǎng)時農桿菌過度生長，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上放置不同層數的濾紙，而該研究中未使用濾紙，在4d時農桿菌沒有過度生長，這樣就降低了試驗操作難度。

有研究表明共培養(yǎng)時的溫度對遺傳轉化效率存在影響{11]。而該試驗由于條件限制，未能完成對共培養(yǎng)溫度的試驗，有待于進一步證明共培養(yǎng)溫度對雪柑遺傳轉化的影響。

3.4生長調節(jié)劑在轉化中的作用

Cervera等{12]發(fā)現在共培養(yǎng)和預培養(yǎng)時使用0.2～1.0mg/L2，4-D可以促進愈傷組織形成，進而提高轉化率和再生率。Ghorbel等{13]和Domínguez等{14]也報導了2，4-D的加入對不定芽的再生關系不大，推測其可導致植物細胞形成感受態(tài)，促進其接收外源DNA，從而提高了轉化效率。Yu等{4]用不同濃度的2，4-D對外植體進行預處理并在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入相應濃度的2，4-D，雪柑轉化率由不進行2，4-D處理的8%提高到了12%，其GUS陽性比例相應提高了33.6%;枳的轉化率由40%提高到80%，GUS陽性比例提高了26.0%，2，4-D濃度過高則會導致愈傷組織大量形成，過夜處理則導致轉化效率降低。這說明2，4-D的加入活化了植物組織細胞，促進了T-DNA的轉移，從而提高了轉化效率。該研究是在已知2，4-D能夠提高轉化率的前提下，用一定濃度的2，4-D對雪柑外植體進行預培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)時加入相應濃度的2，4-D，來優(yōu)化雪柑轉化中所選2，4-D的濃度。從抗性不定芽的長勢來看，1mg/L2，4-D的處理使抗性不定芽篩選后期長勢較好。但預培養(yǎng)時間過長則抗性芽的比例下降，這與Yu等{4]的結論一致。

從該試驗結果可以看出，在篩選培養(yǎng)基中加入BA、NAA、ZT3種不同濃度的生長調節(jié)劑，對抗性芽分化率沒有太明顯的影響，但是對抗性大苗分化率影響較大。這也說明在篩選培養(yǎng)基中加入生長調節(jié)劑不能從根本上影響轉化率的提高，而只是在芽的生長分化中起到了作用，加快了其形態(tài)建成，這也與以往外源激素在組織培養(yǎng)中的作用研究得到統一。在篩選培養(yǎng)基中不同濃度生長調節(jié)劑的組合促進了抗性大苗分化，這為后面轉基因植株的篩選和培養(yǎng)提供了便利。

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