白雪琪等

摘要 ?{目的]獲得可用于篩選膜蛋白酵母雙雜交文庫(kù)的誘餌蛋白載體。{方法]在對(duì)OsVDAC4進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，將OsVDAC4全長(zhǎng)ORF分別與pBT3-N和pBT3-SUC連接，構(gòu)建2個(gè)誘餌蛋白載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub，利用膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)鑒定出可用于篩庫(kù)的誘餌蛋白載體。{結(jié)果]pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以與目標(biāo)蛋白互作，但由于OsVDAC4的N端有約50個(gè)可自由伸展的氨基酸殘基導(dǎo)致pBT3-OsVDAC4-N-Cub本底反應(yīng)非常強(qiáng)，OsVDAC4的C端存在于膜中而沒(méi)有可自由伸展的氨基酸殘基，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的本底反應(yīng)很弱。{結(jié)論]pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可用于文庫(kù)篩選，這為獲取OsVDAC4的互作蛋白提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ??OsVDAC4;誘餌蛋白載體;膜蛋白酵母雙雜交

中圖分類(lèi)號(hào)S??188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）36-0090-05

電壓依賴(lài)性陰離子通道（voltagedepeendentanionchannels，VDACs）最早是從草履蟲(chóng)線粒體外膜上分離得到的{1]，它廣泛存在于線粒體外膜上，是線粒體外膜上最豐富的蛋白之一{2]。VDACs通過(guò)與胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞骨架蛋白以及其他膜通道相互作用，通過(guò)線粒體外膜的代謝物或離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和能量代謝等參與許多細(xì)胞進(jìn)程{3-4]。VDACs可以折疊成19-β-鏈的桶狀結(jié)構(gòu)，且它的N末端在桶外部并且包含α-螺旋結(jié)構(gòu){5]。幾乎所有細(xì)胞功能都依賴(lài)復(fù)雜的蛋白間相互作用來(lái)完成{6]。為了探究水稻中VDAC的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)理，生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物遺傳與發(fā)育課題組之前在日本晴中鑒定出8種VDAC蛋白，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式等進(jìn)行了預(yù)測(cè)，OsVDAC4編碼317個(gè)氨基酸{7]，OsVDAC4蛋白定位于線粒體{8]。為了研究OsVDAC4的作用機(jī)理，必須獲取與其相互作用的蛋白質(zhì)因子。用于膜系統(tǒng)相互作用蛋白篩選的膜酵母雙雜交系統(tǒng)要求相互作用的蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)中，所以該研究針對(duì)預(yù)測(cè)得到的OsVDAC4跨膜方式，構(gòu)建2種不同的OsVDAC4全長(zhǎng)的誘餌蛋白載體（pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub），鑒定出適合篩選OsVDAC4互作蛋白的誘餌載體，為篩選OsVDAC4的互作蛋白奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

酵母菌株NMY51、載體pBT3-N、pBT3-SUC、pPR3-N均購(gòu)自DualsystemsBiotech公司;限制性內(nèi)切酶SfiI、T4DNA連接酶購(gòu)自BioLabs公司;各種氨基酸、YNB、X-Gal、Zbuffer均購(gòu)自Coolaber公司;3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）、RNaseA、鮭魚(yú)精購(gòu)自SIGMA公司;瓊脂、DMSO購(gòu)自賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司;酵母提取物、PEG4000購(gòu)自O(shè)XOID公司;氯化鈉、醋酸鋰、葡萄糖、魚(yú)粉蛋白胨購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;片段回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為公司;ExTaq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;水稻粵泰B幼穗cDNA文庫(kù)、日本晴種子由中南民族大學(xué)生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2儀器

C1000touchthermalcyclerPCR儀（美國(guó)Bio-Rad）;UniversalHoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)）;HeraeusMultifugeX1R高性能通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)）;HeraeusPico21Centrifuge微量臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)）;SBD50-1水浴鍋（丹麥Heto-Holten）;NanodropND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)）;DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó)）;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)（中國(guó)）;72N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（中國(guó)）;ZQZY-70BS兩層小容量振蕩培養(yǎng)箱。

1.3方法

1.3.1

RNA的提取與反轉(zhuǎn)。取日本晴1～2cm的幼穗放入預(yù)處理后預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速研磨，將100mg粉末轉(zhuǎn)移到RNasefree的1.5mLEP管中，加入1mLTRIzol，迅速混勻。室溫靜置5min后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5min。4℃12000r/min離心15min，吸取400μL上清。加入500μL異丙醇，混勻，室溫靜置10min。4℃12000r/min離心15min，得到白色沉淀。沉淀用1mL75%乙醇（DEPC水配制）洗滌2次，晾干后加20μLDEPC水溶解。65℃水浴5min，測(cè)定RNA濃度，取2μLRNA樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)，剩下樣品用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.2

OsVDAC4的擴(kuò)增。從日本晴幼穗cDNA中分別擴(kuò)增出用于連接pBT3-N和pBT3-SUC的目的片段OsVDAC4-N和OsVDAC4-SUC。20μLPCR反應(yīng)體系組成為10×Buffer2μL、2.5mmol/LdNTPsmixture1μL、10μmol/LOsVDAC4ORF擴(kuò)增引物（表1）各0.3μL、5U/μLExTaq0.1μL、cDNA模板1μL，無(wú)菌水15.3μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，剩下產(chǎn)物用于切膠回收。用Axygen公司的切膠回收試劑盒回收目的片段，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.3誘餌蛋白載體構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶SfiI分別酶切PCR擴(kuò)增后回收的OsVDAC4-N、OsVDAC4-SUC以及載體pBT3-N和pBT3-SUC質(zhì)粒。50μL酶切反應(yīng)體系組成為DNA15μL、10×NEBbuffer5μL、20U/μLSfiI1μL、無(wú)菌水29μL，50℃酶切6h。用Axygen公司的清潔回收試劑盒回收酶切后的DNA，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.3.1

目的片段與載體的連接。將回收的目的片段OsVDAC4-N連接載體pBT3-N，OsVDAC4-SUC連接載體pBT3-SUC。20μL連接體系組成為質(zhì)粒1μL、目的片段5μL、10×T4-Ligasebuffer2μL、2.5U/μLT4-Ligase1μL、無(wú)菌水11μL，16℃過(guò)夜。

1.3.3.2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從-80℃冰箱中取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰浴上解凍，加入連接產(chǎn)物，混勻，在冰浴上靜置30min，42℃熱激90s，冰上放置5min，再加入800μLLB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃180r/min1h。取100μL菌液涂抗性平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3.3.3

重組質(zhì)粒的陽(yáng)性鑒定。從平板上挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜（180r/min），取菌液1.4mL收集菌體，加100μLSolutionⅠ使沉淀重懸，加200μLSolutionⅡ，混勻后放置冰浴3min，加150μLSolutionⅢ，混勻后冰浴放置5min。4℃14000r/min離心5min，取上清至另一離心管中，加入2/3體積的異丙醇，搖勻，4℃14000r/min離心10min，沉淀用500μL75%乙醇洗滌2次。晾干后加入30μL1×TE（1∶1000加入RNaseA），溶解后4℃保存。

分別用pBT3-NF/pBT3-NR，pBT3-SUCF/pBT3-SUCR引物（表1）進(jìn)行重組質(zhì)粒的陽(yáng)性鑒定，PCR體系和程序同“1.3.2”。

1.3.4誘餌蛋白載體的篩選。

1.3.4.1

酵母菌株NMY51的活化與收集。取保存的酵母菌株NMY51在1×YPAD平板上劃線后30℃培養(yǎng)3d。挑取單菌落于50mL1×YPAD液體培養(yǎng)基中30℃過(guò)夜培養(yǎng)（200r/min）。當(dāng)酵母OD546達(dá)0.6～0.8時(shí)，將菌液置于冰上至完全冷卻。將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，2500r/min離心5min收集菌體，再用2.5mL無(wú)菌水重懸菌體，置于冰上，備用。

1.3.4.2

PEG/LiOAcMasterMix的制備。將鮭魚(yú)精DNA（10mg/mL）稀釋至2mg/mL，沸水煮10min，立即置于冰上備用。配制PEG/LiOAcMasterMix5份，每份組成為50%PEG4000240μL、1mol/LLiOAc36μL、2mg/mL鮭魚(yú)精DNA25μL，總體積301μL。

1.3.5抑制假陽(yáng)性3-AT濃度的篩選。將質(zhì)粒pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub和pBT3-OsVDAC4-N-Cub分別轉(zhuǎn)化入酵母菌NMY51，獲得含誘餌蛋白載體的酵母菌株。再將文庫(kù)空載質(zhì)粒pPR3-N分別轉(zhuǎn)化入含不同誘餌蛋白載體的酵母菌株，用2×YPAD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)90min（150r/min）。收集菌體并用0.9%NaCl溶液重懸菌體，取300μL菌液涂布含有不同濃度3-AT的SD-Trp-Leu-His-Ade平板，30℃倒置培養(yǎng)3～4d。

1.3.6酵母陽(yáng)性克隆LacZ活性檢測(cè)。參考諶鑫{9]的方法，按20μLX-gal（20mg/mL）∶12μLβ-巰基乙醇∶2mLZbuffer配制染色液，加到放置有2張濾紙的9cm培養(yǎng)皿中，使濾紙浸濕。取一張浸濕的濾紙，覆蓋在已30℃培養(yǎng)3～4d的菌體表面，輕按濾紙后用鑷子小心揭下，并置于液氮中迅速冷凍10～30s，然后在室溫中解凍。將解凍的濾紙置于另一張浸濕的濾紙上，注意讓粘有菌體的一面朝上，趕走濾紙間的氣泡。30℃孵育5min，觀察菌斑是否顯出藍(lán)色。

2結(jié)果與分析

2.1OsVDAC4的跨膜結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用PRED-TMBB{10]和BOCTOPUS{11]在線軟件對(duì)OsVDAC4的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsVDAC4有14次跨膜，其C端跨膜結(jié)構(gòu)較為集中，且C端可能位于膜內(nèi)靠?jī)?nèi)側(cè)、N端位于膜內(nèi)側(cè)（圖1）。進(jìn)一步用I-TASSER預(yù)測(cè)OsVDAC4的空間結(jié)構(gòu){12]，根據(jù)https：∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/預(yù)測(cè)（圖2），OsVDAC4的C端可能位于膜內(nèi)靠?jī)?nèi)側(cè)，與PRED-TMBB和BOCTOPUS的預(yù)測(cè)一致;而N端預(yù)測(cè)結(jié)果稍有差異，有可能位于膜內(nèi)側(cè)，也有可能位于膜外側(cè)，還有可

2.2誘餌蛋白載體構(gòu)建

試驗(yàn)表明，OVDAC4在花藥中有高表達(dá)，而在其他部位幾乎都不表達(dá){7]，所以用日本晴幼穗提取RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，用于擴(kuò)增OsVDAC4。OsVDAC4全長(zhǎng)954bp，從圖3可以看出PCR擴(kuò)增出來(lái)的條帶大小正確，可以用于下一步試驗(yàn)。

將片段用試劑盒回收后，連接載體pBT3-N和pBT3-SUC。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，涂帶有Kan的抗性平板，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。圖4是對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR后的結(jié)果，條帶大小正確，測(cè)序結(jié)果表明序列正確，可用于誘餌蛋白載體的篩選。

2.3OsVDAC4誘餌蛋白載體的篩選

泛素蛋白可以分為Cub（包含泛素蛋白的第34～76氨基酸）和NubI（包含泛素蛋白的第1～38氨基酸），Cub與NubI在自然條件下可以形成完整的泛素蛋白，而將NubI突變成NubG之后，Cub與NubG在自然條件下不能形成完整的泛素蛋白。AIg5蛋白是一種廣泛存在于酵母中的跨膜蛋白，其N(xiāo)端和C端均位于細(xì)胞質(zhì)中。該試驗(yàn)采用3種不同載體的AIg5蛋白（pAI-AIg5-N-NubI、pDL2-AIg5-N-NubG和pCCW-AIg5-C-Cub），pAI-AIg5-N-NubI與pCCW-AIg5-C-Cub作為陽(yáng)性對(duì)照{(diào)9]。為了確定誘餌蛋白OsVDAC4的哪一端存在于細(xì)胞質(zhì)中可以與互作蛋白作用，分別將其N(xiāo)端與帶有Cub的載體pBT3-N相連（pBT3-OsVDAC4-N-Cub），C端與帶有Cub的pBT3-SUC

相連（pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub），當(dāng)誘餌蛋白載體連有泛素Cub的N端或C端也位于細(xì)胞質(zhì)時(shí)，便能同AIg5的N

端或C端連接上的NubI相互結(jié)合，形成完整泛素分子，最終導(dǎo)致報(bào)告基因的表達(dá)，酵母可以在四缺培養(yǎng)基SD-Trp-Leu-His-Ade（SD-4）上生長(zhǎng)，GUS染色為藍(lán)色。該試驗(yàn)將5組質(zhì)粒DNA分別共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照組（pAI-AIg5-N-NubI+pCCW-AIg5-C-Cub）在SD-Trp-Leu（SD-2）平板上長(zhǎng)出白色菌落，在四缺培養(yǎng)基SD-Trp-Leu-His-Ade平板上稀釋了10-4后也長(zhǎng)出菌落（圖5A），說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照組間的互作明顯高于試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-OsVDAC4-N-Cub（第2組）和pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub（第3組）在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上都有生長(zhǎng)，在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上也有生長(zhǎng)，但第3組在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于第2組。在SD-Trp-Leu平板上第2組長(zhǎng)出的菌落是白色的，而第3組長(zhǎng)出的菌落是粉紅色的，根據(jù)DUALmembranestarterkitsUserManual上的說(shuō)明，當(dāng)2個(gè)蛋白之間相互作用弱時(shí)，

酵母體內(nèi)的腺嘌呤合成途徑受阻，會(huì)有紅色代謝物積累，因

此酵母會(huì)呈現(xiàn)出粉紅色，而第3組在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上呈現(xiàn)出白色菌落，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好，SD-Trp-Leu培養(yǎng)

基中要比SD-Trp-Leu-His-Ade培養(yǎng)基中多加了Ade和His這2種氨基酸，由此推測(cè)在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上酵母呈現(xiàn)出粉紅色可能是由于培養(yǎng)基中的Ade足夠酵母生長(zhǎng)所需，不需要自身合成，于是酵母呈現(xiàn)粉紅色。但陰性對(duì)照組pBT3-OsVDAC4-N-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第4組）和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第5組）在SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade平板上均有生長(zhǎng)，第5組的長(zhǎng)勢(shì)較弱（圖5A）。進(jìn)一步檢測(cè)LacZ的活性，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組也能染為藍(lán)色（圖5B）。這些結(jié)果說(shuō)明pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以用于篩選膜酵母雙雜交文庫(kù)，但可能具有較高的本底反應(yīng)。

為了降低本底反應(yīng)，進(jìn)行3-AT的嚴(yán)謹(jǐn)性優(yōu)化。將文庫(kù)空載pPR3-N分別轉(zhuǎn)化至含有誘餌蛋白載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的酵母菌株中。pPR3-N上帶有突變的NubG，誘餌蛋白載體pBT3-SUC-OsVDAC4上帶有Cub，為了減少假陽(yáng)性，消除本底反應(yīng)，在用3-AT來(lái)減少假陽(yáng)性的同時(shí)也使蛋白互作相對(duì)較弱的菌能夠生長(zhǎng)，設(shè)置了4個(gè)濃度梯度，分別是0、1.0、2.5、5.0mmol/L，重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果表明在不加3-AT的條件下文庫(kù)空載pPR3-N與誘餌蛋白載體pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub沒(méi)有發(fā)生本底反應(yīng)（圖6），而文庫(kù)空載pPR3-N與誘餌蛋白載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub在試驗(yàn)所用的3-AT濃度范圍內(nèi)本底反應(yīng)很強(qiáng)，隨后加大3-AT濃度，到80mmol/L還是有很強(qiáng)的本底反應(yīng)。這些結(jié)果說(shuō)明誘餌蛋白載體pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可以用于膜酵母雙雜交文庫(kù)的篩選。

3討論

生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物遺傳與發(fā)育課題組之前在日本晴中鑒定出了8個(gè)VDAC基因，即OsVDAC1～8。利用生物信息學(xué)方法對(duì)OsVDAC1～8進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，并通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析了OsVDAC1～8的表達(dá)模式，嘗試構(gòu)建部分OsVDACs的RNAi植株，并取得初步成功。然后對(duì)OsVDACs的原核、真核表達(dá)進(jìn)行研究，并對(duì)OsVDACs進(jìn)行亞細(xì)胞定位。通過(guò)膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)從YTB幼穗cDNA文庫(kù)中篩選到了OsVDAC3的3個(gè)互作蛋白，成功得到了OsVDAC3超表達(dá)植株，并進(jìn)一步驗(yàn)證了OsVDAC3與其互作蛋白間的互作。成功得到了OsVDAC5的RNAi轉(zhuǎn)基因植株，并篩選得到了7個(gè)與OsVDAC5（1～75aa）互作的蛋白{9]，將其命名為OsV5IP1～7，為了探索OsVDAC5（1～75aa）與OsV5IP1～7是否真正互作，還進(jìn)行了酵母雙雜、pulldown、BiFC、亞細(xì)胞定位，試驗(yàn)結(jié)果顯示它們之間發(fā)生了互作。

該試驗(yàn)從日本晴幼穗cDNA中擴(kuò)增出OsVDAC4全長(zhǎng)片段，連接載體pBT3-N和pBT3-SUC，得到重組載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub。在正式篩選文庫(kù)之前對(duì)2個(gè)誘餌蛋白載體進(jìn)行篩選，結(jié)果表明pBT3-OsVDAC4-N-Cub的試驗(yàn)組和陰性對(duì)照都長(zhǎng)勢(shì)良好，相比較而言，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的試驗(yàn)組長(zhǎng)勢(shì)良好的同時(shí)，陰性對(duì)照長(zhǎng)勢(shì)較弱。并且在之后的3-AT濃度篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub與文庫(kù)空載幾乎沒(méi)有發(fā)生本底反應(yīng)，而pBT3-OsVDAC4-N-Cub與文庫(kù)空載發(fā)生的本底反應(yīng)難以抑制，所以pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub載體更合適篩庫(kù)。根據(jù)生物信息學(xué)分析，上述試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于OsVDAC4的C端位于膜結(jié)構(gòu)中，與之相連的Cub自由度較小，難以與沒(méi)有互作的空間上較遠(yuǎn)的NubG反應(yīng)，因此本底反應(yīng)弱。OsVDAC4的N端Cub與沒(méi)有互作的空載上的NubG具有很強(qiáng)的互作，說(shuō)明其N(xiāo)端沒(méi)有在膜內(nèi)側(cè)或膜中間的桶狀結(jié)構(gòu)中，而是位于膜外側(cè)的細(xì)胞質(zhì)中;由于其N(xiāo)端有約50個(gè)氨基酸殘基在膜結(jié)構(gòu)外面處于伸展?fàn)顟B(tài)，因此與它相連的Cub可以與在空間上相距很遠(yuǎn)的NubG互作，表現(xiàn)為很強(qiáng)的本底反應(yīng)。綜上所述，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub更適合于下一步進(jìn)行互作蛋白的篩選。

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