從夕漢等

摘要{目的]研究水稻穗部葉綠體發(fā)育的分子機(jī)制。{方法]本文以秈型恢復(fù)系RH003的自然突變體wp6為研究材料，從農(nóng)藝性狀、稻米品質(zhì)和葉綠素含量比較了突變體和野生型，并以突變體與日本晴、9311雜交構(gòu)建F2群體來(lái)研究wp6的遺傳模式。{結(jié)果]突變體整株葉片呈綠色，抽穗期至成熟期，穗部白色，穗軸和小梗為綠色。與野生型相比，wp6的生育期、株高、有效穗數(shù)、每穗總粒以及每穗實(shí)粒略高，而wp6的結(jié)實(shí)率（66.85%）則遠(yuǎn)低于野生型RH003的82.40%。成熟期米質(zhì)分析表明，突變體的外觀品質(zhì)和蒸煮食味比野生型略差。苗期突變體和野生型葉片葉綠素含量差異不大，抽穗期時(shí)突變體白穗性狀是由于葉綠素a含量低所致。對(duì)wp6與正常葉色品種雜交F1、F2代的遺傳分析表明，該性狀受1對(duì)隱性核基因調(diào)控。{結(jié)論]該研究為wp6基因的定位、克隆和功能研究奠定基礎(chǔ)，也為水稻標(biāo)記性狀育種提供新的資源。

關(guān)鍵詞水稻（OryzasativaL.）;白穗突變體;葉綠體;遺傳分析

中圖分類號(hào)S??511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）36-0029-03

隨著世界人口的持續(xù)增長(zhǎng)，特別是隨著氣候干旱和自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生，提高光合效率已經(jīng)成為作物育種的重要目標(biāo){1]。葉綠素（Chlorophyll，Chl）是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，葉綠素合成缺陷突變是一類明顯的性狀突變。高等植物中葉綠素包括葉綠素a（chlorophylla）和葉綠素b（chlorophyllb）2種，葉綠素生物合成從L-谷氨酰-tRNA到葉綠素a，葉綠素a再經(jīng)葉綠素酸酯a加氧酶氧化即形成葉綠素b，整個(gè)生物合成過(guò)程需要15步反應(yīng)，涉及15種酶，在擬南芥中已分離了27個(gè)編碼這些酶的基因{2-3]，水稻中有17個(gè)編碼這些酶的基因。整個(gè)合成過(guò)程主要分為2個(gè)部分：從L-谷氨酰-tRNA到原卟啉Ⅸ（protoⅨ）的生物合成和原卟啉Ⅸ（protoⅨ）到葉綠素的生物合成{4]。葉綠素合成途徑中，任何一個(gè)基因的突變都可能會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成受阻，改變其含量，從而形成不同程度和不同表型的葉色變化{5-7]。目前，水稻中已發(fā)現(xiàn)和鑒定了160多個(gè)關(guān)于葉色的突變體，包括黃花、淺綠、白化及紫色等性狀{8-10]。與葉片相比，盡管水稻穗部葉綠體色素含量相對(duì)要少、光合效率低，但穗部光合作用對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響程度及穗部葉綠體發(fā)育的分子機(jī)理尚不清晰。有研究表明，在抽穗期對(duì)水稻穗部分別套不透明和透明袋，套不透明袋的水稻千粒重和結(jié)實(shí)率都明顯低于套透明袋{11]。另外，在育種方面，標(biāo)記性狀的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，穗部突變體的穗部顏色可有效應(yīng)用于不育系和雜交水稻的品種純度鑒定，有效降低了機(jī)械化制種的成本{12]。

筆者從優(yōu)良秈型兩系恢復(fù)系RH003獲得1個(gè)新的白穗突變體wp6，暫命名為wp6（whitepanicles6），對(duì)該新白穗突變體的表型特征、主要農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)以及遺傳模式進(jìn)行了觀察和分析，旨在為水稻白穗突變體wp6的基因定位、克隆和功能研究以及在育種上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

白穗突變體wp6系從優(yōu)良兩系恢復(fù)系育種材料RH003中獲得，已種植多個(gè)世代，穗部白化表型等農(nóng)藝性狀在合肥、海南兩地都能穩(wěn)定遺傳。突變體整株葉片呈綠色，抽穗期至成熟期穗部白色，穗軸和小梗為綠色，以野生型品種RH003為對(duì)照。

1.2wp6表型特征觀察及主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

試驗(yàn)于2016年在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所國(guó)家水稻育種改良分中心（合肥）的網(wǎng)室進(jìn)行。5月1日播種，5月30日移栽，單本種植，株行距20cm×20cm，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，田間種植，3次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)10行，每行11株，按正常田間肥水管理，及時(shí)防治水稻病蟲害。根據(jù)葉齡，全生育期觀察供試材料葉色變化情況，抽穗期之后每隔1d記載穗部顏色。

供試水稻品種成熟后，排除邊際效應(yīng)，分別從每行第3株開始連續(xù)取5株葉突變體和野生型晾干考種，測(cè)定對(duì)照及各處理品種產(chǎn)量及其構(gòu)成因素，調(diào)查生育期、株高、有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等主要農(nóng)藝性狀。

1.3稻米品質(zhì)的測(cè)定

測(cè)定前剔除空秕粒，根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的標(biāo)準(zhǔn)NY/T593—2013{13]測(cè)定米粒的長(zhǎng)寬比、堊白率、堊白度和透明度以及稻米的膠稠度和堿消值;直鏈淀粉含量采用瑞典FOSS流動(dòng)注射分析儀測(cè)定。

1.4光合色素含量測(cè)定

采用丙酮浸提的方法提取色素，抽穗期時(shí)，取抽穗期RH003和wp6材料的劍葉（完全伸展開）葉片和幼穗，稱量約30～200mg后剪碎，置于相應(yīng)體積的80%丙酮中，室溫避光放置24h，中間多次混勻。5000r/min離心10min，吸取上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Spectrumlab752Pro）分別測(cè)定663、645和470nm處的吸光值，參照Lichtenthaler{13]的方法計(jì)算葉片單位質(zhì)量葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素x（Chlx）的含量，公式如下：

1.5wp6的遺傳分析

于2015年3月在海南三亞用白穗突變體wp6分別與正常穗部顏色水稻品種日本晴和9311正反交得到4個(gè)F1（wp6/日本晴，日本晴/wp6;wp6/93-11，93-11/wp6），種植F1獲得F2。于2016年5月2日在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所國(guó)家水稻育種改良分中心進(jìn)行播種，6月1日移栽，單本種植。抽穗期時(shí)，觀察和統(tǒng)計(jì)F2群體中突變表型和正常表型的植株數(shù)，計(jì)算分離比，應(yīng)用孟德?tīng)栠z傳規(guī)律進(jìn)行遺傳分析，通過(guò)x2測(cè)驗(yàn)，推斷wp6的遺傳模式。

1.6數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理采用MicrosoftExcel2007軟件和SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

2結(jié)果與分析

2.1wp6的表型特征及主要農(nóng)藝性狀

通過(guò)田間觀察，野生型的葉片全生育期都為綠色，抽穗期穗部穎殼為綠色，成熟期穎殼為金黃色。突變體wp6全生育期葉片均為綠色，穗部穎殼顏色從抽穗期到成熟期一直為白色。與野生型RH003相比，wp6的生育期、株高、有效穗數(shù)、每穗總粒以及每穗實(shí)粒略高，wp6的穗長(zhǎng)和千粒重略低，而wp6的結(jié)實(shí)率（66.85%）明顯低于野生型RH003的82.40%（表1）。

2.2稻米品質(zhì)比較

成熟期對(duì)突變體和野生型的稻米外觀品質(zhì)和蒸煮食味進(jìn)行比較（表2），與野生型RH003相比，突變體wp6的長(zhǎng)寬比、膠稠度明顯低。而wp6的堊白度、透明度、堿消值以及直鏈淀粉含量均高于野生型RH003。野生型和突變體稻米的膠稠度和直鏈淀粉含量相差較大。以上結(jié)果表明，突變體的外觀品質(zhì)和蒸煮食味比野生型略差。

2.3葉綠素含量比較

突變體和野生型在田間種植時(shí)，對(duì)苗期（4葉期）葉片的葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Chlx）進(jìn)行了檢測(cè)（圖1A），突變體和野生型葉片中的葉綠素a的含量均明顯大于葉綠素b和類胡蘿卜素，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量相近，而突變體葉片中的葉綠素b則低于野生型。突變體和野生型穗部抽出一半時(shí)，對(duì)穗部穎殼中的葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素進(jìn)行了檢測(cè)（圖1B），結(jié)果顯示與野生型相比，突變體穗部穎殼中的葉綠素b含量略高，類胡蘿卜素含量略低，而葉綠素a的含量則遠(yuǎn)低于野生型RH003。以上結(jié)果表明，突變體和野生型苗期葉片葉綠素含量差異不大，抽穗期時(shí)突變體白穗性狀是由于葉綠素a含量低所致。

2.4遺傳分析

突變體wp6分別與正常穗部顏色的水稻品種日本晴和9311進(jìn)行正反交并種植，整個(gè)生育期，4個(gè)F1雜交種植株葉片均為綠色，抽穗期F1的穗部顏色均為綠色。抽穗期雜交組合wp6/日本晴和wp6/93-11的F2群體中正常穗部顏色植株與白穗植株分離十分明顯，經(jīng)x2檢驗(yàn)均符合3∶1的分離比（表4），表明wp6的白穗性狀由1對(duì)隱性核基因控制。

3結(jié)論與討論

目前，關(guān)于水稻穗部失綠的突變體報(bào)道較少，Sanchez等{14]較早報(bào)道的白穗突變體wp1和wp2，主要特征大致相同，成熟植株穗表現(xiàn)為白色，植株基部3個(gè)葉片表現(xiàn)出白色條斑。不同的是wp1突變體的穗軸和小梗表現(xiàn)為綠色，wp2則表現(xiàn)出白色的穗軸和小梗，2個(gè)基因分別位于第7和第1染色體上。Song等{10]研究發(fā)現(xiàn)wlp1的表型受低溫影響，在低溫條件下，wlp1幼苗和穗部表現(xiàn)葉綠素缺陷。該基因被定位在第1染色體長(zhǎng)臂上，編碼核糖體L13蛋白質(zhì)。金怡等{15]研究發(fā)現(xiàn)，wslwp的葉片苗期由白色轉(zhuǎn)為條紋葉，隨著植株的發(fā)育葉片顏色幾乎恢復(fù)正常，至抽穗時(shí)穎殼顏色為白色，穗軸和小枝梗表現(xiàn)為綠色，穗粒成熟時(shí)變?yōu)辄S色，葉綠素含量隨葉色和穎殼顏色的變化發(fā)生了相應(yīng)的變化，葉綠體發(fā)育表現(xiàn)出了明顯的時(shí)間和組織特異性。該突變體被定位在第7染色體短臂上。Li等{16]鑒定了wp（t）是1個(gè)白穗突變體，少數(shù)葉片中脈呈現(xiàn)白色，控制該性狀的基因已被定位在第1染色體上。王曉雯等{11]研究發(fā)現(xiàn)wp4全生育期葉色黃綠，抽穗灌漿期內(nèi)外穎呈乳白色，穗軸顏色不變。穎殼中，wp4的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量均極顯著下降，細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯的葉綠體結(jié)構(gòu)，該基因已被定位在第8染色體上。該研究使用的穗部白化材料是優(yōu)良秈型兩系恢復(fù)系RH003的自然突變體，已種植多個(gè)世代，穗部白化表型等農(nóng)藝性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，突變體整株葉片呈綠色，抽穗期至成熟期穗部白色，穗軸和小梗為綠色，且性狀不受溫度影響。因此，推測(cè)突變體wp6是由新的位點(diǎn)突變引起。

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