袁光宇 龔維瑤 賈玲玲

摘要[目的]檢測(cè)貴陽(yáng)市河水中大腸桿菌O157：H7。[方法]通過(guò)大腸桿菌O157：H7毒力基因志賀樣毒素2（stx2）、α-溶血素（hlyA）、緊密黏附素（eaeA）設(shè)計(jì)3對(duì)引物，并建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)8株菌株進(jìn)行特異性、靈敏度檢測(cè)，利用該方法檢測(cè)了采集自貴陽(yáng)市部分河流10組水樣。[結(jié)果]該方法能夠特異擴(kuò)增大腸桿菌O157：H7毒力基因，靈敏度為127 ng/mL;檢測(cè)水樣結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法相比，其靈敏度為87.5%，特異度為97.1%，準(zhǔn)確度為94.0%。[結(jié)論]該方法的建立能夠?yàn)榇竽c桿菌O157：H7檢測(cè)提供較好的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞實(shí)時(shí)PCR;大腸桿菌O157：H7;毒力基因

中圖分類號(hào)R123.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0167-02

Detection of Escherichia coli O157：H7 from River Water of Guiyang City

YUAN Guangyu，GONG Weiyao，JIA Lingling et al（Guizhou Kwinbon Science and Technology for Food Safety Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009）

Abstract[Objective] The research aimed to detect the Escherichia coli O157：H7 from river water of Guiyang City[Method]3 pairs of primers were designed by using E.coli O157：H7 virulence gene Shiga toxin 2 （Stx2），alpha hemolysin （hlyA） and tight adhesin （eaeA）.Quantitative realtime PCR assay was established to detect the specificity and sensitivity of the 8 strains.10 water samples collected from some rivers in Guiyang City were detected by this method.[Result]The method could amplify the virulence gene of E.coli O157：H7 and the sensitivity was 127 ng/mL.Compared with the national standard method，the sensitivity of the detected water sample was 87.5%，the specificity was 97.1%，and the accuracy was 94.0%.[Conclusion]The establishment of the method can provide a good theoretical basis for the detection of E.coli O157：H7.

Key wordsRealtime PCR;Escherichia coli O157：H7;Virulence gene

腸出血性大腸桿菌是大腸桿菌成員中的一個(gè)亞型，主要分為26、111、157這3類血清型，感染后能導(dǎo)致人類出現(xiàn)出血性腸炎、溶血性綜合癥而得名，3類血清型中主要能引起人類感染性腹瀉的菌株是O157：H7[1-2]。大腸桿菌是污染食品導(dǎo)致食品安全事件的微生物重要組成之一，病原菌的污染可能在食品的生產(chǎn)與加工、食品包裝、運(yùn)輸、保存及消費(fèi)等各環(huán)節(jié)。大腸桿菌的檢測(cè)方法主要有常規(guī)的培養(yǎng)鑒別檢測(cè)方法、膠體金試紙條、免疫磁珠分離檢測(cè)、PCR檢測(cè)等[3-5]。

在食品生產(chǎn)交易鏈中，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定方法需要多個(gè)步驟檢測(cè)，檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不能滿足食品安全快速檢測(cè)要求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）是能特異性擴(kuò)增DNA片段的分子生物學(xué)方法，在生物體外實(shí)現(xiàn)DNA的復(fù)制，以熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)DNA的總量[6-7]。筆者建立于大腸桿菌O157：H7毒力基因志賀樣毒素2（stx2）、α-溶血素（hlyA）、緊密黏附素（eaeA）基因設(shè)計(jì)引物片段[6-7]，Real-time PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因組依據(jù)熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

1材料與方法

1.1試材試驗(yàn)涉及菌株信息見(jiàn)表1。DNA Maeker、DNA提取試劑盒DP302購(gòu)買(mǎi)于天根生化科技有限公司;2×SYBR Green PCR Mastermix購(gòu)買(mǎi)于Solarbio;其他化學(xué)試劑購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥。

1.2儀器凝膠成像儀BIO-RAD、電泳儀購(gòu)買(mǎi)于Thermo公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)買(mǎi)于Thermo;高速離心機(jī)5424D型購(gòu)買(mǎi)于Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)。

搜索GenBank公布的大腸桿菌O157：H7菌株志賀樣毒素2（AF162758.1）、α-溶血素（U12572.1）、緊密黏附素（U32312.1）基因序列，利用Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息如下所示：

hlyA-For：5′-TCTGACAGGAGGAAGCGGTA-3′

hlyA-Rev：5′-CTCCTGAGGCATCTTTCGCA-3′

stx2-For：5′-AACTGCATATTGCCCCGTCA-3′

stx2-Rev：5′-TGTGATGGATGGTGCCAGAC-3′

eaeA-For：5′-AGCGTTACGTTTCCCTCTCG-3′

eaeA-Rev：5′-CCGGGTCCGGGTATAACAAC-3′

1.3.2DNA的提取及反應(yīng)體系建立。表1各細(xì)菌接種在10 mL 適宜液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過(guò)夜，按DNA提取試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA。

Real-time PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2×Mastermix 10 μL，Primer for/rev 2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃持續(xù)5 min。

1.3.3特異性及靈敏度測(cè)試。

利用建立的Real-time PCR反應(yīng)體系，以3對(duì)特異性引物分別檢測(cè)表1中所示菌株基因組DNA。大腸桿菌O157：H7基因組DNA按10倍梯度稀釋至10-6，取1 μL作為模板，用于驗(yàn)證方法的靈敏度。

1.3.4樣本檢測(cè)。

采集自貴陽(yáng)市部分河流水樣50份，分別進(jìn)行增菌后，按建立的Real-time PCR試驗(yàn)方法和微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1方法特異性

經(jīng)熒光等溫?cái)U(kuò)增儀擴(kuò)增表1中8株細(xì)菌基因組DNA，熒光信號(hào)強(qiáng)度結(jié)果如圖1所示，將同一菌株P(guān)CR產(chǎn)物混合后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。圖1顯示，大腸桿菌O157：H7所擴(kuò)增基因stx2、hlyA、eaeA熒光信號(hào)呈指數(shù)增加，其余7株均未檢測(cè)到熒光信號(hào)的變化。圖2顯示，8株細(xì)菌擴(kuò)增基因僅大腸桿菌O157：H7出現(xiàn)3條DNA條帶，分別為522、386、279 bp。

2.2靈敏度測(cè)試

大腸桿菌O157：H7基因組DNA經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)濃度為127 ng/μL，按10倍梯度稀釋至10-6，取1 μL作為模板，將引物混合按建立的檢測(cè)方法驗(yàn)證其靈敏度，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)DNA濃度為127 ng/mL時(shí)40 min后熒光信號(hào)呈指數(shù)增加。因此，該研究建立的方法其靈敏度為127 ng/mL。

2.3水樣檢測(cè)采集自貴陽(yáng)市10處河流每處5份水樣，共計(jì)10組50份。分別采用Real-time PCR方法和國(guó)標(biāo)方法GB 4789.36—2016

檢測(cè)大腸桿菌O157：H7，Real-time PCR方法和國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)比較結(jié)果如表2。結(jié)果顯示（表2），測(cè)出陽(yáng)性樣品分別為Real-time PCR方法15份、國(guó)標(biāo)方法16份;陰性樣本分別為Real-time PCR方法35份、國(guó)標(biāo)方法34份。分析結(jié)果可知，建立的Real-time PCR檢測(cè)靈敏度為87.5%，特異度為97.1%，準(zhǔn)確度為94.0%。

3討論

大腸桿菌O157：H7污染食品是食品安全事件的主因之一，各地區(qū)時(shí)有檢出[9-10]。大腸桿菌O157：H7侵襲力極強(qiáng)，人類感染后出現(xiàn)出血性結(jié)腸炎、溶血性貧血、尿毒癥等癥狀，因而我國(guó)及歐盟國(guó)家都明確規(guī)定不得檢出[11-12]。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法所耗時(shí)間長(zhǎng)，PCR 技術(shù)近年來(lái)在檢測(cè)致病微生物上是較為快捷、可靠的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷害沙門(mén)氏菌等微生物的檢測(cè)[13-15]。

Real-time PCR方法相較于PCR法能夠?qū)z測(cè)結(jié)果實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)化，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[16]。根據(jù)GenBank中所查詢的大腸桿菌O157：H7菌株stx2（AF162758.1）、hlyA（U12572.1）、eaeA（U32312.1）毒力基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度分別為522、386、279 bp，能夠避免檢測(cè)單一基因出現(xiàn)的假陽(yáng)性，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)需求。根據(jù)引物優(yōu)化，該研究建立的3個(gè)毒力基因退火溫度均為60 ℃，可以實(shí)現(xiàn)3對(duì)引物在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增，其靈敏度為127 ng/mL。利用該研究建立的方法檢測(cè)采集自貴陽(yáng)市部分河流50份水樣，在個(gè)別樣本檢測(cè)時(shí)有較小出入，但每組檢測(cè)

結(jié)果一致。因此，該研究所建立的檢測(cè)方法能夠?yàn)闄z測(cè)大腸桿菌O157：H7提供理論支持。

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