吳昌林 劉彬 謝本華 畢思遠 朱海 李曉娜

摘要 [目的]采用免疫膠體金技術(shù)，建立了一種快速檢測玉米赤霉醇的試紙條方法。[方法]利用有機合成方法，研制了一種玉米赤霉醇半抗原，將其載體蛋白偶聯(lián)得到免疫抗原，并通過人工免疫的方法獲得單克隆抗體。通過酶聯(lián)免疫法對制備的單克隆抗體的性能進行了驗證。玉米赤霉醇層析試紙條是利用單克隆抗體標記膠體金，其原理是玉米赤霉醇抗原和羊抗鼠IgG分別噴到自制的膜（硝酸纖維）上，然后將樣品墊、吸水墊分別放置在PVC板上，再制成試紙條。[結(jié)果]試紙條檢測限可達0.5～1.0 μg/kg，具有速度快、簡單等優(yōu)點。此外，該試紙條與大部分的玉米赤霉醇沒有明顯的交叉反應(yīng)。[結(jié)論]利用該試紙條可實現(xiàn)對生鮮乳中玉米赤霉醇添加試驗的準確判定。該試紙條有望實現(xiàn)對生鮮乳中玉米赤霉醇殘留的快速篩查。

關(guān)鍵詞 生鮮乳；玉米赤霉醇；試紙條；單克隆抗體；免疫層析；膠體金

中圖分類號 TS207文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0151-04

Abstract [Objective] The research aimed to establish a rapid strip detection method for zeranol by immune gold colloid technology. [Method]The hapten of zeranol was prepared via a synthetic organic method， and was conjugated with the carrier protein to obtain the antigen. Monoclonal antibody was obtained with the artificial immune method and its affinity was verified with the enzyme immunoassay. The colloid gold immunochromatographic strip was prepared with monoclonal antibody conjugated gold colloid which was stored in microwells， and a PVC liner which was assembled with nitrocellulose membrane sprayed with zeranol antigen and goat anti-mouse IgG， sample pad and absorbent pad.[Result]The strip had a detection limit in the range of 0.5 - 1.0 μg/kg with the advantages of fastness， easiness， etc. In addition， the strip did not cross-react with most of the pyrethroid pesticides tested. [Conclusion]With the strip，the accurate determination of the addition of zearalan in raw milk is achieved. This strip is expected to achieve fast screening of zearalenol residues in raw milk.

Key words Raw milk；Zeranol；Strip； Monoclonal antibody；Immune-chromatography；Colloidal gold

玉米赤霉菌在生長過程中會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物玉米赤霉醇（zeranol），玉米赤霉醇亦是玉米赤霉烯酮的還原產(chǎn)物，具有類似雌激素活性[1]。玉米赤霉醇對動物腦下垂體和胰臟產(chǎn)生作用，影響生物體內(nèi)甲狀腺素水平及生殖系統(tǒng)的生長發(fā)育，促進機體蛋白質(zhì)的合成。它曾作為動物尤其是牛羊的生長促進劑，促進動物對飼料的利用率并提高其增重率，以提高經(jīng)濟效益。然而，畜禽攝取含有玉米赤霉醇的食物后，在其組織及體液中（乳汁）會有一些殘留。這些殘留會引起人體性激素水平失調(diào)從而影響人類健康。當(dāng)機體攝取的玉米赤霉醇超過一定量時，可能會影響第二性征的正常發(fā)育甚至癌變[2-3]。1998年歐盟禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物用于畜禽飼養(yǎng)。我國衛(wèi)生部于2010年明確禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物用于畜禽生長促進劑。為保證食品安全，對動物源性食物及其制品中玉米赤霉醇的檢測非常重要。

傳統(tǒng)測定玉米赤霉烯醇的方法主要基于色譜分離和酶聯(lián)免疫法，主要有薄層色譜[1]、高效液相色譜（HPLC）[4-5]、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）[6-7]和酶聯(lián)免疫（ELISA）方法等[8-9]。傳統(tǒng)方法檢測首先要采用有機溶劑對樣品中目標物進行提取，然后利用萃取或免疫親和柱等前處理方法進行樣品前處理，以去除雜質(zhì)。與大型儀器檢測相比，酶聯(lián)免疫分析方法檢測成本低，可同時實現(xiàn)對多個樣品檢測。但是，酶聯(lián)免疫法不僅需要具備專業(yè)知識的人員操作，而且試驗結(jié)果易受外界因素干擾而產(chǎn)生較大影響，如提取溶液的離子強度、孵育溫度等，另外不同樣品基質(zhì)對結(jié)果影響也很大。與ELISA方法相比，膠體金免疫層析方法是一種更簡便、快速的檢測方法[10-12]，其具有前處理方便、檢測效率高、能通過肉眼直接判斷結(jié)果等優(yōu)點。筆者依據(jù)膠體金層析原理，即抗原、抗體之間的競爭反應(yīng)，開發(fā)出了一種鮮乳中玉米赤霉醇殘留的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MSQDESI液質(zhì)聯(lián)用儀（AB4000+）；IKA RV10 V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州艾卡）；電動加熱攪拌器IKA basic（廣州艾卡）；氯金酸；玉米赤霉醇等標準品；溴乙酸叔丁酯；牛血清蛋白（BSA）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，安耐吉公司）；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）；吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、三氯甲烷、二氯甲烷、三氟乙酸等有機試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 玉米赤霉醇半抗原、抗原的合成

半抗原的合成流程見圖1。準確稱取0.16 g的玉米赤霉醇，加入碳酸鉀0.5 g、DMF 10 mL，50 ℃反應(yīng)10 min后滴加溴乙酸叔丁酯0.2 g，加畢后80 ℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束后將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸干，加水，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥處理后蒸干；在冰浴下，將溶有的中間產(chǎn)物用10 mL二氯甲烷溶解，緩慢滴加5 mL三氟乙酸5 mL，反應(yīng)2 h，將溶劑蒸干，再次加水，用乙酸乙酯萃取，蒸干溶劑得到玉米赤霉醇半抗原。

稱取玉米赤霉醇半抗原15 mg，溶于2 mL DMF 加入36 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、34 mg EDC-HCl；將32 mg BSA溶于體積為3.2 mL的0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH 9.0），加入1 mL DMF，0.5 mL上述溶液室溫反應(yīng)過夜，對PBS透析2～3 d，離心，分裝，凍存。

1.3 單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫（ELISA）表征

按照人工抗原免疫的方法，對健康的雌性BALB/c小鼠進行免疫42～56 d。具體流程如下：第1次免疫采用弗氏完全佐劑乳化50 μg人工抗原，第2次、第3次、第4次免疫時采用不完全佐劑乳化，每次處理時間間隔為14 d。等到最后一次免疫3 d之后，在無菌室內(nèi)將小鼠脾細胞取出，再將其與骨髓瘤細胞SP2/0（比例為5∶1）用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)方法進行融合。將融合的細胞培養(yǎng)后，利用間接競爭ELISA 法選擇單克隆抗體細胞株，再利用獲得的細胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水，最后再加入飽和硫酸銨溶液，沉淀并純化制得抗玉米赤霉醇的單克隆抗體。將純化后的單克隆抗體包被在酶聯(lián)免疫板上，利用ELISA方法測定單克隆抗體的性能。

1.4 膠體金的制備方法

按照檸檬酸三鈉法分別制備膠體金（直徑約為40 nm）。制備過程：將燒瓶、球形冷凝管、加熱套、冷凝水搭建一個回流裝置，將50.0 mL質(zhì)量分數(shù)為0.01%的氯金酸溶液置于燒瓶中加熱至沸騰，再迅速加入質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液0.50 mL，待反應(yīng)完全且溶液顏色保持穩(wěn)定，繼續(xù)加熱回流 10 min，冷卻，冷藏備用。

1.5 膠體金標記抗體

膠體金標記抗體制備金標抗體探針的方法參照文獻[9]進行，即取適量熬制好的膠體金溶液至250 mL燒杯中，用 0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH，用一級水溶解抗體至膠體金1/10體積，逐滴加入已熬制好膠體金溶液，不斷攪拌反應(yīng) 0.5 h，抗體標記濃度分別為 0.5、1.0、 2.0 μg/mL，然后按膠體金1/10的體積逐滴加入濃度為10%的BSA，繼續(xù)攪拌封閉 0.5 h，再繼續(xù)按膠體金1/10體積逐滴加入 1%聚乙二醇（PEG 20000），攪拌封閉 0.5 h后，在9 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速離心0.5 h，用吸管吸去上清后，并加入原體積 1/10的復(fù)溶液（含 有1% BSA、2%蔗糖、0.05% PEG 20000、0.1% NaN3的pH為7.4的0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液）重懸金標抗體。

1.6 玉米赤霉醇膠體金試紙條的制備方法

將玉米赤霉醇抗原用PBS溶液稀釋成濃度為1.5 mg/mL的溶液，再將羊抗鼠IgG用PBS稀釋成1 mg/mL的溶液。用噴膜機將上述2種溶液以1.0 μL/cm的速度噴于硝酸纖維膜上，分別形成控制線（C）和檢測線（T）2條線，然后將噴制好的硝酸纖維膜置于37 ℃培養(yǎng)箱中干燥4 h。最后將硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊按順序粘貼在PVC襯板上，將其切割成4 mm等寬的試紙條，即可。

1.7 試紙條檢出限試驗

用陰性生鮮乳為基質(zhì)，分別將陰性基質(zhì)、含玉米赤霉醇競爭物質(zhì)濃度為 0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 ng/mL 的加標基質(zhì)，點樣于1、2、3、4、5、6 號同一批次試紙條，比較結(jié)果：T 線和 C 線皆顯色確定為陰性，T 線不顯色或顯色明顯變淡而C 線顯色則為陽性，C 線不顯色則確定無效。分別檢測3 批次樣品，每批次重復(fù) 10次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.8 試紙條特異性試驗

選擇與玉米赤霉醇結(jié)構(gòu)相近的類似物，如α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮，用生鮮乳位基質(zhì)將其分別稀釋至0.5、1.0、2.0 ng/mL備用，用不含玉米赤霉醇陰性基質(zhì)作為對照組，分別點樣于同一批制備的試紙條，觀察結(jié)果。分別檢測 3 批次樣品，每批次重復(fù)10次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.9 試紙條穩(wěn)定性試驗

取制備的同一批次試紙條，檢查其活性，時間間隔為30 d；當(dāng)時間間隔達到1個月后，隨機抽取試紙條進行 3 批樣品檢測，每批次重復(fù) 10次，取平均值作為檢測結(jié)果，考察其穩(wěn)定性。

1.10 試紙條重復(fù)性試驗

對同一批次的試紙條分別進行3個批次樣品的檢測，每批次重復(fù)檢測 10次；取同一樣品，分別用3 個不同批次的試紙條檢測，每批次重復(fù)檢測 10次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.11 試紙條實際樣品加標與干擾試驗

對8個不同來源的牧場鮮奶，選取其中2個分別加入200 μg/kg三聚氰胺、4 μg/kg青霉素G抗生素，與其他6個牧場鮮奶一起共8組樣品，經(jīng)儀器方法定量不含玉米赤霉醇后，分別對空白對照組的8組樣品各重復(fù)20次檢測，以及各添加1 μg/kg玉米赤霉醇加標物后，對8組加標樣品各重復(fù)20次檢測，看實際樣品加標結(jié)果與存在干擾物質(zhì)的實際樣品檢測結(jié)果情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成

玉米赤霉醇的合成路線如圖1所示，與溴乙酸叔丁酯反應(yīng)得到叔丁酯化物中間體，該中間體通過三氟乙酸反應(yīng)獲得脫除叔丁基的目標物。使用溴代某酸叔丁酯為連接手臂的好處是在最后的脫酯過程中不使用強堿，保證了玉米赤霉醇分子內(nèi)的酯鍵不發(fā)生水解活性受到破壞。

2.2 ELISA檢測單克隆抗體的靈敏度

為了驗證純化后玉米赤霉醇抗體的靈敏度情況，利用ELISA法進行驗證試驗。繪制玉米赤霉醇ELISA標準曲線如圖2，從圖中可以看出，玉米赤霉醇抗體對玉米赤霉醇在0.1～10.0 μg/kg具有較好的線性關(guān)系，從而證明了該方法制備的單克隆抗體對玉米赤霉醇具有高選擇性和靈敏性，所以利用該單克隆抗體制備的快速檢測試紙條可以對含有玉米赤霉醇的樣品進行快速、高靈敏檢測。

2.3 膠體金標記玉米赤霉醇單克隆抗體

按該試驗方法制備的膠體金顏色為酒紅色，直徑約為40 nm，最大吸收波長約為528 nm。通過 Mey氏穩(wěn)定性試驗，確定最佳標記量和最佳標記 pH，獲得標記的最優(yōu)條件為pH 8.5 Tris緩沖溶液（0.1 mol/L），抗體與膠體金的最佳比例為5 μg/mL。試驗證明，在此條件下膠體金聯(lián)苯菊酯單克隆抗體復(fù)合物最穩(wěn)定，未出現(xiàn)團聚等現(xiàn)象。因而，利用pH為8.5 Tris緩沖溶液（0.1 mol/L），比例為抗體與膠體金（5 μg/mL）進行標記。

2.4 玉米赤霉醇試紙條的最小檢測限

試紙條檢出限試驗中，每批次的試紙條結(jié)果中3～6號試紙條均能穩(wěn)定得出T線顏色變?nèi)跤贑線，或明顯弱于C線顏色，甚至T線消失而C線顏色開始逐漸變強，即在0.5 μg/kg濃度點開始檢出陽性結(jié)果。

分別選擇含有不同濃度的玉米赤霉醇樣品（0、0.5、1.0、2.0 μg/kg），利用制備的玉米赤霉醇試紙條檢測，重復(fù)5次檢測的結(jié)果如圖3。試驗證明，當(dāng)樣品中含有玉米赤霉醇的濃度逐漸變高時，試紙條中T線的顏色逐漸減弱，而C線的顏色逐漸加強，與預(yù)期結(jié)果一致。當(dāng)玉米赤霉醇的濃度為0時，T線顏色明顯強于C線顏色，結(jié)果判定為陰性；當(dāng)玉米赤霉醇的濃度為0.5 μg/kg時，T線強度與C線顏色相當(dāng)，結(jié)果判定為弱陽性；當(dāng)玉米赤霉醇的濃度為1.0 μg/kg時，T線顏色比C線顏色弱，結(jié)果判定為陽性；當(dāng)玉米赤霉醇的濃度為2.0 μg/kg時，T線幾乎不顯示，結(jié)果判定為強陽性。表明該試驗制得的試紙條對玉米赤霉醇的檢測濃度為0.5～1.0 μg/kg，檢測結(jié)果重復(fù)性好。

2.5 交叉反應(yīng)

從試紙條分別對6種濃度為4 μg/kg玉米赤霉醇類似物重復(fù)測試5次的結(jié)果（表1）可以看出，試紙條對6種類似物重復(fù)5次試驗的結(jié)果均為陰性，表明試紙條對6種不同的結(jié)構(gòu)類似物（4 μg/kg）是沒有交叉反應(yīng)。雖然這6種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與玉米赤霉醇十分相似，但試紙條均能準確辨別，進一步證明了該試紙條具有良好的特異性。

2.6 試紙條穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗

試紙條穩(wěn)定性試驗中，取3批試紙條每隔1個月重復(fù)檢測配標濃度為1.0 μg/kg的樣品，10次重復(fù)的結(jié)果均顯色一致，且T線均明顯淺于C線，結(jié)果穩(wěn)定。

試紙條重復(fù)性試驗中，取3批試紙條，針對3組不同樣品進行10次重復(fù)試驗，結(jié)果顯示，空白組的3批試紙條共30次檢測結(jié)果均為陰性；而2組對照加標組，3批試紙條各重復(fù)10次的結(jié)果，共60次檢測結(jié)果均為陽性，且顯色結(jié)果一致，重復(fù)性好。

2.7 實際樣品的加標與干擾試驗

分別取8組不同牧場的新鮮生鮮乳各200 μL加入微孔中，再加入玉米赤霉醇標準品混勻后，用試紙條對樣品重復(fù)檢測20次。結(jié)果表明（表2），沒有加入玉米赤霉醇的對照組中，各牧場20次的檢測結(jié)果均為陰性，當(dāng)加入標液濃度為1.0 μg/kg的玉米赤霉醇時，20次檢測的結(jié)果均為陽性。可見，按照該試驗制備的試紙條對濃度為1.0 μg/kg的玉米赤霉醇檢測準確，結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，當(dāng)有三聚氰胺與青霉素G抗生素干擾物存在時，檢測結(jié)果也不受干擾。

3 結(jié)論

該研究利用有機合成的方法首先制備玉米赤霉醇半抗原，然后利用人工免疫小鼠制備單克隆抗體，該抗體對玉米赤霉醇具有特異性識別能力，再將所制備的單克隆抗體標記到膠體金表面，分裝至微孔反應(yīng)杯凍干。最后將玉米赤霉醇抗原與羊抗鼠二抗噴制在硝酸纖維素膜上，再將硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊依次粘附在PVC地板上，制備出玉米赤霉醇快速檢測試紙條。該試紙條的檢測限可達0.5～1.0 μg/kg，符合歐盟及國家標準規(guī)定的限量范圍。試驗證明，該方法具有檢測快速、前處理過程操作方便的優(yōu)點，經(jīng)新鮮生鮮乳樣品檢測驗證，該方法能夠滿足鮮乳中殘留玉米赤霉醇現(xiàn)場快速篩查的要求，可在乳品企業(yè)中推廣應(yīng)用。

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