張桂清　林偉達(dá)　姚俊新

摘要[目的]探討復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取靈芝流浸膏的最佳工藝條件，以期為靈芝流浸膏的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。[方法] 以菌草鹿角靈芝為原料，采用靈芝流浸膏的提取和復(fù)合酶用量配比、復(fù)合酶酶解條件、超聲波條件正交試驗對復(fù)合酶協(xié)同超聲波技術(shù)提取菌草靈芝流浸膏的工藝進(jìn)行研究，并與傳統(tǒng)水浴浸提法進(jìn)行對比。[結(jié)果] 復(fù)合酶協(xié)同超聲技術(shù)提取靈芝流浸膏的最佳工藝條件：酶組成為纖維素酶2.0 g，木瓜蛋白酶0.8 g，果膠酶3.0 g；酶解條件為酶解溫度60 ℃，pH 5.5，時間80 min；超聲條件為時間15 min，功率500 W，溫度55 ℃。對照試驗結(jié)果表明，常規(guī)浸提法提取流浸膏得率為2.71%，而復(fù)合酶協(xié)同超聲波法提取流浸膏得率為66.90%，復(fù)合酶協(xié)同超聲波法提取流浸膏的得率約是常規(guī)浸提法的25倍。[結(jié)論]采用復(fù)合酶協(xié)同超聲波技術(shù)，提高了菌草靈芝流浸膏和多糖得率，顯著縮短了提取時間，且降低了提取液黏度，為靈芝流浸膏和多糖的提取提供了一種可行的方法。

關(guān)鍵詞靈芝；流浸膏； 復(fù)合酶；超聲波

中圖分類號R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）28-0151-04

Study on Extraction of Ganoderma lucidum Flow Extract by Complex Enzyme Combined with Ultrasonic Technique

ZHANG Guiqing，LIN Weida，YAO Junxin et al

（Fujian Agricuture and Forestry University China National Engineering Research Center of Juncao Technology，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002 ）

Abstract[Objective]The optimal process conditions of complex enzyme extraction combined with ultrasonic extraction of Ganoderma lucidum extract were discussed in order to provide theoretical basis for the industrial production of Ganoderma lucidum extract. [Method]Using Juncao antlers Ganoderma lucidum as raw materials，the process of using complex enzyme combined with ultrasonic technique to extract Juncao Ganoderma lucidum extraction was studied by extraction of Ganoderma lucidum extract and the Orthogonal test on the ratio of complex enzymes， enzymatic hydrolysis conditions and ultrasonic conditions，and compared with traditional water bath extraction.[Result]The optimal process conditions of complex enzyme combined with ultrasonic technique to extract Juncao Ganoderma lucidum extraction， the enzyme composition was cellulase 2.0 g， papain 0.8 g， pectinase 3.0 g；the enzymolysis conditions were as follows， the temperature was 60 ℃， the pH was 5.5， the time was 80 minutes； ultrasound conditions，time was 15 minutes， power was 500 W， temperature was 55 ℃. The contrast experiment showed that the extract yield of flow extract was 2.71% by using conventional extraction， while that of flow extract was 66.90% by compound enzyme synergistic ultrasonic method，and the extract rate of flow extract by compound enzyme synergistic ultrasonic method was about 25 times of that of flow extract by conventional extraction method. [Conclusion]Synthetic enzyme synergistic ultrasonic technology improves the yield of Juncao Ganoderma lucidum extract and polysaccharide， significantly shortens the extraction time， and reduces the viscosity of the extract.It provides a feasible method for extracting Ganoderma lucidum extract and polysaccharide.

Key wordsGanoderma lucidum；Flow extract；Complex enzyme；Ultrasonic

靈芝是《神農(nóng)本草經(jīng)》記載的名符其實的“上上藥”，被視為吉祥長壽的象征，享有“仙草”的美譽。而菌草鹿角靈芝比一般靈芝的有效成分高3%，安全性也較高，具有提高免疫力、改善睡眠、抗腫瘤、保肝、輔助治療關(guān)節(jié)炎等保健作用。靈芝切碎，按一定工藝參數(shù)提取、濃縮、蒸干得到的提取物，呈深黃褐色的膏狀物，稱為靈芝流浸膏，它的有效成分非常豐富，主要含有多糖類、三萜類、甾醇類、核苷類、氨基酸及微量元素等[1]。靈芝多糖是靈芝的主要功效成分之一，大多為異多糖，主要為葡萄糖，少量為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖等[2]，其中靈芝多糖因其抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗衰老等作用倍受人們關(guān)注，具有廣泛的藥理活性，能提高機(jī)體免疫力和耐缺氧能力，有消除自由基、抗衰老、抑制腫瘤、降血壓、降血脂等作用[3]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，靈芝中的三萜類成分也是其主要有效成分之一，具有抗腫瘤、保肝、免疫促進(jìn)、調(diào)血脂和降血糖、抗真菌等多種藥理作用[4] 。

關(guān)于段木靈芝的研究很多，有大量的文獻(xiàn)可查，技術(shù)和方法都比較成熟，但是對于菌草靈芝的研究鮮有報道，而現(xiàn)今菌草靈芝憑借其生產(chǎn)成本低、成品質(zhì)量高等優(yōu)勢，已逐漸在全國推廣，成為靈芝研究領(lǐng)域的重要品種。但關(guān)于菌草靈芝流浸膏方面的研究還是空白，因此開展菌草靈芝流浸膏生產(chǎn)工藝研究意義重大。

有研究報道，將酶用于中藥的提取制備中，效果良好。如纖維素酶、果膠酶等可以破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，從而有利于有效成分的溶出[5]。酶解法通過酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來強化有效成分的傳質(zhì)過程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性[6]，而在提取過程中，利用超聲波產(chǎn)生強烈的振動、較高的加速度、強烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，能加速有效成分進(jìn)入溶劑，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機(jī)械振動、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速有效成分的擴(kuò)散釋放[7]，與常規(guī)溶劑提取相比，超聲波輔助提取是近年來發(fā)展較快的新型提取方法，具有高效性、強選擇性、提取時間短、能耗低等特點[8]。為此，筆者采用正交試驗設(shè)計法優(yōu)化復(fù)合酶并協(xié)同超聲波提取菌草靈芝流浸膏的最佳工藝條件并同傳統(tǒng)方法的提取結(jié)果進(jìn)行了比較，探索各因素對靈芝流浸膏指標(biāo)性成分含量的影響，以期提高提取效率、縮短提取時間和降低能耗，為改進(jìn)靈芝流浸膏的生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。菌草鹿角靈芝，購于福建農(nóng)林大學(xué)小賣鋪。

1.1.2

主要儀器。超離心研磨儀（德國，RetschZM200）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；pH計（雷磁pHS-3C，廈門精藝興科技有限公司）；磁力攪拌器（IKA-Werke GmbH and Co.KG）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52CS（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（貢義市予華儀器有限責(zé)任公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（國華電器有限公司）。

1.1.3

主要試劑。纖維素酶400 U/mg、木瓜蛋白酶1 000 U/mg、果膠酶500 U/mg、醋酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

1.2方法

1.2.1

靈芝流浸膏的提取。菌草鹿角靈芝子實體做成切片，放在烘箱中65 ℃烘干后用超離心研磨儀研磨成菌草鹿角靈芝粉末，過80目篩。稱取5.0 g靈芝子實體粉末，加入一定pH的緩沖液（醋酸-醋酸鈉緩沖液pH為4.6～5.5，磷酸鹽緩沖液pH為6.5）100.0 mL和適量的酶，充分混勻，恒溫酶解。反應(yīng)結(jié)束后，將其置于100 ℃水浴中10 min使酶滅活，冷卻至室溫，提取液經(jīng)過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿減壓濃縮至10 mL左右，冷凍干燥至恒重，計算靈芝流浸膏粉的提取率。

靈芝流浸膏粉提取率=靈芝流浸膏質(zhì)量 /靈芝粉質(zhì)量×100%

1.2.2

復(fù)合酶用量配比正交試驗。在60 min、50 ℃、pH為5的酶解條件下，以纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶的用量為正交試驗的3個因素，每個因素各設(shè)定4個水平，進(jìn)行L16（43） 正交試驗（表1）。

1.2.3

復(fù)合酶酶解條件正交試驗。根據(jù)最佳復(fù)合酶用量配比試驗結(jié)果，以酶提溫度、pH、酶提時間作為考察因素，每個因素各設(shè)定3個水平，進(jìn)行L9（33）正交試驗（表2）。

1.2.4

超聲波條件正交試驗。根據(jù)最佳復(fù)合酶用量配比試驗以及最佳酶解條件試驗結(jié)果，以超聲時間、溫度、功率作為考察因素，每個因素各設(shè)定3個水平，進(jìn)行L9（33）正交試驗（表3）。

1.2.5

復(fù)合酶-超聲協(xié)同提取法與傳統(tǒng)水浴浸提法的比較。為了考察復(fù)合酶-超聲波協(xié)同提取法與傳統(tǒng)水浴浸提法對靈芝流浸膏提取率的影響，稱取5.0 g靈芝粉8份，其中4份按照復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取最佳工藝條件進(jìn)行提取，另外4份分別加入100 mL濃度40%乙醇水浴浸提80 min，溫度60 ℃。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合酶用量配比

酶法是一種通過酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來強化有效成分的傳質(zhì)過程，是一種最大限度地提取中藥有效成分的方法[9]，目前報道的酶法提取中，酶制劑大多采用纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶[9]，所以筆者選用這3種酶作為復(fù)合酶組成成分進(jìn)行研究，并和不加酶的傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行比較。從表4可以直觀看出，菌草鹿角靈芝流浸膏的最佳提取工藝為A4B4C3，即纖維素酶（A）2.0 g、木瓜蛋白酶（B）0.8 g，果膠酶（C）3.0 g組合，在60 min、50 ℃、pH 4.6的酶解條件下，靈芝流浸膏的平均提取率為56.81%。極差（R）反映了同一因素取不同水平時K值的變化幅度，為同一因素下不同水平對應(yīng)的最大值與最小值之差。變化幅度越大，說明該因素對試驗結(jié)果的影響越大，它就越重要[10]。從纖維素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果膠酶（C）的極差R值分別為17.64、15.84、13.45可以推導(dǎo)出，三者對結(jié)果的影響從大到小依次為纖維素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果膠酶（C）。由直觀分析數(shù)據(jù)看，因素A、B、C的G值均大于1.5，即各因素均為主要因素[11]，影響程度依次為A、B、C。但直觀分析法不能對誤差大小進(jìn)行估計，也不能知道分析的精度，為了進(jìn)一步判斷試驗誤差與試驗條件是否影響試驗結(jié)果，將正交試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，找出主要因素。從正交試驗方差分析結(jié)果可知，F(xiàn)A=7.56，F(xiàn)B=5.40，F(xiàn)C=4.90?？梢?，纖維素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果膠酶（C）對菌草鹿角靈芝流浸膏提取率都有顯著影響，纖維素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果膠酶（C）都為主效因子。

根據(jù)正交試驗結(jié)果推導(dǎo)的最佳組合A4B4C3進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3次，結(jié)果制備的靈芝流浸膏提取率平均值為56.81%，RDP=6.65%，為最大值。

2.2復(fù)合酶酶解條件

選取靈芝作為酶法提取的對象，試圖

破壞靈芝的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來提高靈芝有效成分提取效率，對于實際應(yīng)用有著現(xiàn)實的意義。從表5可以直觀看出，菌草

鹿角靈芝流浸膏的最佳提取工藝為A3B2C2，即酶解溫度（A）為60 ℃，pH（B）5.5，時間（C）80 min。從溫度（A）、pH（B）、時間（C）的R值分別為3.01、3.30、11.83可知，時間（C）對結(jié)

果的影響最大，溫度（A）對結(jié)果的影響最小，即因素主次排列順序為C>B>A。由直觀分析數(shù)據(jù)看，因素A、B的G值均小于1.5，即溫度（A）、pH（B）均為次要因素；時間（C）的G值大于1.5，即時間（C）為主要因素。從正交試驗方差分析結(jié)果可知，溫度（A）、pH（B）、時間（C）的FA=0.28，F(xiàn)B=0.27，F(xiàn)C=

2.3超聲波條件

超聲波輔助提取是利用超聲波的空化作用、機(jī)械作用、熱效應(yīng)等增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑的穿透力，從而提高中藥成分的浸出率，具有省時、節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點，值得一提的是它沒有因較高溫度減弱有機(jī)成分的活性[12-13]。該技術(shù)具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點。從表6可以直觀看出，菌草鹿角靈芝流浸膏的提取工藝為A2B3C3，即超聲時間（A）為15 min，功率（B）為500 W，溫度（C）為55 ℃。由正交表極差（R）分析可知，因素主次排列順序為C>B>A，即影響因素依次為溫度（C）、功率（B）、時間（A）。由直觀分析數(shù)據(jù)看，因素A、B、C的G值均小于1.5，即時間（A）、功率（B）、溫度（C）因素均為次要因素。

從正交方差分析結(jié)果可知，超聲時間（A）、功率（B）、溫度（C）F值分別為FA=0.132、FB=0.294、FC=0.554，可見它們對菌草鹿角靈芝流浸膏提取率都沒有顯著影響，即時間、功率、溫度都不是主效因子。

2.4復(fù)合酶超聲協(xié)同提取法與傳統(tǒng)水浴浸提法比較結(jié)果

采用常規(guī)浸提法提取的菌草鹿角靈芝流浸膏得率為2.71%，復(fù)合酶協(xié)同超聲波法提取的菌草鹿角靈芝流浸膏得率為66.90%，復(fù)合酶協(xié)同超聲波法提取的菌草鹿角靈芝流浸膏得率約是常規(guī)浸提法的25倍。復(fù)合酶-超聲波協(xié)同提取法提高了靈芝多糖提取率，可能是由于以下原因造成的：超聲破碎是利用超聲波振動傳遞能量，改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能或加速這些改變過程，從而提高多糖得率，縮短提取時

間，降低提取液黏度；生物酶技術(shù)是一種新型高效綠色提取技術(shù)，對多糖的破壞較小，操作相對簡單且能保證較高的得率，酶解法減少了化學(xué)試劑的使用，有利于資源的利用和環(huán)境的保護(hù)[14]。

3結(jié)論與討論

復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取靈芝流浸膏的最佳工藝條件：復(fù)合酶組成為纖維素酶2.0 g，木瓜蛋白酶0.8 g，果膠酶3.0 g；酶解條件為酶解溫度60 ℃，pH 5.5，時間80 min；超聲條件為時間15 min，功率500 W，溫度55 ℃。在復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取最佳工藝條件下，菌草鹿角靈芝流浸膏得率為66.90%，常規(guī)浸提法提取菌草鹿角靈芝流浸膏得率為2.71%，復(fù)合酶協(xié)同超聲波法提取菌草鹿角靈芝流浸膏得率約是常規(guī)浸提法的25倍，且顯著縮短了提取時間。

中藥浸膏粉的吸濕性是長期困擾中藥制劑生產(chǎn)的主要問題，藥浸膏粉吸潮后變軟、結(jié)塊，流動性變差，給生產(chǎn)和貯藏帶來困難并影響中藥制劑的質(zhì)量和療效。長期以來在中藥制劑生產(chǎn)實踐中，人們發(fā)現(xiàn)中藥浸膏的質(zhì)量與其物理性質(zhì)有著密切的關(guān)系，菌草靈芝膏就是由于流動性較差、吸濕性較強，最終導(dǎo)致重復(fù)驗證試驗很難進(jìn)行。

另外，該試驗菌草鹿角靈芝是在學(xué)校小賣鋪中購買的，生長時期不同，而不同生長時期的菌草鹿角靈芝切片的流浸膏提取率是不同的，這也導(dǎo)致重復(fù)驗證試驗很難進(jìn)行。在今后的研究過程中，如果能精心挑選同一生長時期的菌草鹿角靈芝切片進(jìn)行流浸膏提取，效果一定會更好。

參考文獻(xiàn)

[1] 王明蛟，高航，剛婉嬌，等.靈芝化學(xué)成分分析方法的研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，30（5）：817-819.

[2] 劉佳，王勇.靈芝多糖的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27（6）：629-634.

[3] 唐曉璇，王成忠，李雙.靈芝多糖的研究進(jìn)展[J].山東食品發(fā)酵，2014（2）：28-31.

[4] 李國華，李曄，梅錫玲，等.靈芝三萜類化合物研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（12）：1858-1862.

[5] 王蕓蕓，李莉，李香玉，等.復(fù)合酶法提取甘草渣中總黃酮[J].化學(xué)與生物工程，2008，25（8）：49-51.

[6] 呂興萍，楊薇紅，馬春嬌.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：258-260.

[7] 鄭丹婷，蔡思敏，苑子涵，等.靈芝多糖的提取、分離及分析方法的研究進(jìn)展[J].機(jī)電信息，2016（11）：33-38.

[8] 范金波，侯宇，周素珍，等.超聲波輔助酶法提取黑木耳多糖工藝條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技，2014，50（6）：31-35.

[9] 朱玲，史吉平，王晨光，等.響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝多糖的酶法提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2016，37（24）：238-244.

[10] 馬麗娟，王婷婷.麥冬多糖提取工藝的研究[J].黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2010，12（4）：26-30.

[11] 呂圭源.中藥新產(chǎn)品開發(fā)學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：65.

[12] 李鵬婧，柳旭光，龍海榮，等.超聲波輔助提取菱角殼總黃酮及抗氧化性研究[J].食品科技，2011（1）：167-171.

[13] 林士惠，易運紅，龍梓，等.超聲波輔助提取香蕉葉多糖工藝的優(yōu)化[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，45（2）：295-298.

[14] 張慧瑛，羅光宏，郝軍元，等.超聲波-生物酶法提取鎖陽多糖工藝優(yōu)化及其抗腫瘤活性[J].食品科學(xué)，2016，37（12）：59-64.