黃枝英　許朝輝　周婷

摘要介紹淮山組織培養(yǎng)的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，包括不同外植體的莖尖培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等方法，總結(jié)淮山組織培養(yǎng)的條件和目前存在的問(wèn)題，并提出今后的展望。

關(guān)鍵詞淮山；組織培養(yǎng)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)S632.1；Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0029-03

Research Progress on Tissue Culture of Dioscorea opposita Thunb

HUANG Zhiying ， XU Chaohui ， ZHOU Ting et al（Quanzhou Institute of Agricultural Science，Quanzhou， Fujian 362212）

AbstractThe advance of Dioscorea opposita Thunb tissue culture was introduced at home and abroad，including stem tip culture，callus culture and protoplast culture in the different explants.Culture conditions and main problems in Dioscorea opposita Thunb tissue culture were summarized and the development direction in the future was proposed.

Key wordsDioscorea opposita Thunb；Tissue culture；Research progress

淮山（Dioscorea opposita Thunb）屬薯蕷科薯蕷屬一年生或多年生草質(zhì)藤本植物，其地下肉質(zhì)根狀莖和地上枝的葉腋著生的零余子皆為產(chǎn)品， 是藥食兼用的高效經(jīng)濟(jì)作物。我國(guó)淮山栽培歷史悠久，自夏、商起就開始種植，據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，淮山含多糖、淀粉、蛋白質(zhì)、游離氨基酸和微量元素等多種成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗突變、調(diào)節(jié)脾胃功能等功效[1-2]，是中國(guó)著名的補(bǔ)益中藥，也是傳統(tǒng)的保健菜肴。但由于長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖，致使品質(zhì)退化，產(chǎn)量降低，某些優(yōu)良品種（如鐵棍山藥）已被廣大藥農(nóng)放棄種植，幾乎處于瀕臨滅絕的境地[3]，因此，改善品質(zhì)、提高產(chǎn)量、推廣種植優(yōu)良品種已成為淮山生產(chǎn)中亟待解決的重要問(wèn)題。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能保持原有優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還可加快品種提純復(fù)壯及繁種速度，是目前淮山優(yōu)良品種迅速推廣種植的一條較為實(shí)用的途徑。

國(guó)內(nèi)外對(duì)淮山組培快繁技術(shù)的研究早已有之。20世紀(jì)70年代中期，隨著植物組培快繁技術(shù)開始在薯蕷屬植物中得到應(yīng)用，不少科研機(jī)構(gòu)和單位對(duì)淮山莖尖、葉片、莖段、余零子等不同外植體的培養(yǎng)進(jìn)行廣泛的研究[4-8]。 筆者對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外淮山組織培養(yǎng)方面的研究成果，包括不同外植體的莖尖培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)、原生質(zhì)體培養(yǎng)，以及培養(yǎng)基的選擇、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用和培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行總結(jié)，提出存在的問(wèn)題以及今后的展望，以期為該領(lǐng)域今后的研究提供參考。

1淮山外植體組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段稱為外植體，包括莖尖、莖段、皮層、表皮、塊莖、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等；外植體的選取是否恰當(dāng)對(duì)植物組織離體快繁起著至關(guān)重要的作用。目前，淮山組織培養(yǎng)技術(shù)使用的外植體主要包括莖段（帶頂芽和腋芽）、葉片、零余子、塊莖、珠芽和原生質(zhì)體等。根據(jù)使用的外植體和培養(yǎng)途徑，淮山組織培養(yǎng)技術(shù)可歸類為莖尖培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。

1.1莖尖培養(yǎng)

由于植物細(xì)胞具有全能性，因此任何組織或器官在條件適應(yīng)的情況下均可再生成完整植株。但不同種類的植物以及同一植物的不同器官對(duì)外界誘導(dǎo)的條件反應(yīng)敏感程度是不同的。因此，外植體取材時(shí)應(yīng)選擇再生能力強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好、來(lái)源豐富、容易滅菌的器官，對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，莖尖是最佳的外植體材料，其形態(tài)已基本建成，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無(wú)病毒苗的重要途徑。

淮山莖尖培養(yǎng)多以零余子或塊莖上萌發(fā)的幼苗莖段（頂芽和腋芽）作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。南懷林等[9]以山藥莖尖為外植體誘導(dǎo)形成試管苗，結(jié)果表明，用長(zhǎng)0.3～2.0 mm的莖尖培養(yǎng)時(shí)， 成苗率與莖尖長(zhǎng)度呈正相關(guān)；不同來(lái)源的莖尖， 成苗率沒(méi)太大區(qū)別， 但以大田莖尖形成的試管苗質(zhì)量最好。張志勇等[10]通過(guò)對(duì)具有閩西地方特色的山藥優(yōu)良品種（龍巖市新羅懷山藥）進(jìn)行莖尖組培試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)最適宜新羅懷山藥莖尖誘導(dǎo)成苗的培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mol/L KT+0.2 mol/L NAA，其誘導(dǎo)的成苗率高達(dá)60%，成苗較快，同時(shí)指出細(xì)胞分裂素KT比6-BA更有利于新羅懷山藥的莖尖誘導(dǎo)成苗。李明軍[11]研究懷山藥帶節(jié)莖段，指出帶節(jié)莖段在Ms+ l～2 mol/L 6-BA+0.1～1.0 mol/L NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，均能直接形成多芽體，均芽數(shù)為3～ 5個(gè)，將多芽體轉(zhuǎn)入MS或MS+2 mol/L KT+0.02 mol/L NAA+0.1 mol/L PP333的培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)生根，形成再生植株。許多研究表明利用淮山莖段為外植體，生長(zhǎng)勢(shì)較旺盛，帶菌較少，可直接分化出多芽體，不容易變異，是淮山莖尖組織培養(yǎng)的優(yōu)良材料。

1.2愈傷組織培養(yǎng)

植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等器官及其組織，均可培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，并能不斷繼代培養(yǎng)，用以研究植物的生長(zhǎng)與發(fā)育，脫分化與再分化，遺傳變異與育種。因此，愈傷組織是植物離體培養(yǎng)與生物工程的良好試驗(yàn)體系。

李明軍等[12]認(rèn)為不同基因型山藥（鐵棍山藥、“47號(hào)”山藥和太谷山藥）均能誘導(dǎo)形成愈傷組織，但出愈率不同；同一基因型外植體（零余子、葉片、莖段、莖尖）不同，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果也不同，即莖尖優(yōu)于零余子；而零余子的出愈率優(yōu)于莖段、葉片，這與梁方剛等[13]的研究結(jié)論是一致的。同時(shí)指出細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素二者配合使用可誘導(dǎo)形成愈傷組織，植物激素種類、濃度和配比不同，出愈率也不同，說(shuō)明植物激素按一定比例進(jìn)行組合是誘導(dǎo)愈傷組織形成的關(guān)鍵因子。

1.3原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物原生質(zhì)體在適宜的條件下具有再生成與其親本相近個(gè)體的全能性，可經(jīng)離體培養(yǎng)得到再生植株。借助原生質(zhì)體培養(yǎng)及誘導(dǎo)融合技術(shù)可獲得雜種和多倍體植株，可有效克服植物有性雜交不親和現(xiàn)象，有利于培育新品種[14]。

關(guān)于馬鈴薯[15]和甘薯[16]等原生質(zhì)體再生試驗(yàn)國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于淮山原生質(zhì)體培養(yǎng)的報(bào)道較少。Tor等[17]研究山藥原生質(zhì)體的培養(yǎng)，結(jié)果表明，在合適的培養(yǎng)條件下，山藥生長(zhǎng)早期葉片（長(zhǎng)度< 110 cm） 可以誘導(dǎo)出生產(chǎn)量和存活力都較高的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)要求較高，難度大，目前還需要經(jīng)過(guò)探索和研究，以促進(jìn)育種工作的進(jìn)行。

此外，20世紀(jì)80年代，一些研究者對(duì)薯蕷植物體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)進(jìn)行研究，目前有些種離體培養(yǎng)胚胎的萌發(fā)率可達(dá)100%。薯蕷屬植物體胚培養(yǎng)的再生植株，葉形、大小和倍性水平變異很大，從二倍體到多倍體到非整倍體，偶見白化突變型和花葉植株[18]。雖然現(xiàn)在利用體胚培養(yǎng)還不可能進(jìn)行薯蕷植物的大量、快速繁殖，但是利用體胚培養(yǎng)獲得的優(yōu)良個(gè)體作為育種和細(xì)胞、組織培養(yǎng)的起始材料仍有一定意義。在植物細(xì)胞培養(yǎng)方面，我國(guó)已開展盾葉薯蕷高皂素含量植株的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)研究以及三角葉薯蕷的細(xì)胞培養(yǎng)。隨著科技的不斷發(fā)展，這方面的技術(shù)將越來(lái)越成熟，能夠更好地促進(jìn)育種工作的進(jìn)行。

1.4培養(yǎng)基的選擇

關(guān)于薯蕷植物的快速繁殖，培養(yǎng)基類型是其組織培養(yǎng)的重要影響因子，大部分學(xué)者以MS為基本培養(yǎng)基；也有人以改良MS、B5和MS培養(yǎng)基混合為基本培養(yǎng)基探討培養(yǎng)基類型對(duì)組織培養(yǎng)的影響[19]。牛潔等[20]以畢克齊山藥零余子為外植體，以MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS為基本培養(yǎng)基，在無(wú)附加激素的情況下，1/4MS培養(yǎng)基上零余子誘導(dǎo)率最高，為40%，不加激素MS培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最低。孟玲等[19]用盾葉薯蕷的腋芽和頂芽作外植體，試驗(yàn)MS與B5組合的5種培養(yǎng)基對(duì)芽誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)MS與B5混合培養(yǎng)基中添加AgNO3，對(duì)芽的誘導(dǎo)有顯著地促進(jìn)作用；采用1/2MS為基本培養(yǎng)基對(duì)盾葉薯蕷的生根效果最好?？偟膩?lái)說(shuō)，在淮山組織培養(yǎng)中，供試品種及其外植體類型不同，基本培養(yǎng)基類亦不同，但以MS為基本培養(yǎng)基居多。

1.5植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用

在淮山組織培養(yǎng)中， 使用的生長(zhǎng)素類有NAA 和2，4-D，細(xì)胞分裂素類有6-BA、KT、BAP 和2ip等[21]，但最常見的是將生長(zhǎng)素NAA和分裂素6-BA組合使用。李明軍等[11-12]認(rèn)為， 在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中， 在沒(méi)有或單獨(dú)使用1種激素的培養(yǎng)基上均不能誘導(dǎo)愈傷組織的形成， 而細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素二者配合使用則可以誘導(dǎo)形成愈傷組織，同時(shí)也指出PP333具有抑制愈傷組織形成的作用，而GA3與6-BA、NAA組合使用對(duì)愈傷的誘導(dǎo)具有協(xié)同促進(jìn)作用。

除6-BA與NAA作為主要的誘導(dǎo)激素外，已有研究表明添加KT、PP333、10%的椰汁等激素或天然物質(zhì)對(duì)芽誘導(dǎo)具有不同程度的促進(jìn)效應(yīng)。李明軍[11]研究指出在多芽體的形成過(guò)程中，PP333促使多芽體中芽的數(shù)目增多，對(duì)多芽分化有促進(jìn)作用，并認(rèn)為可能是通過(guò)降低莖段內(nèi)源GA的含量實(shí)現(xiàn)的。蘇超等[22]對(duì)細(xì)毛山藥莖尖培養(yǎng)的研究指出KT促進(jìn)不定芽再生，其成苗作用顯著優(yōu)于6-BA，KT與NAA或IAA組合對(duì)細(xì)毛山藥的組培苗建立和繁殖有良好作用。

一般認(rèn)為器官分化的傾向是取決于內(nèi)源細(xì)胞分裂素（CK） 和生長(zhǎng)素的平衡， 由于植物的外植體中原有的內(nèi)源激素種類和濃度不同， 為達(dá)到這種平衡， 需要補(bǔ)加的激素種類及濃度也就不同。相關(guān)的研究也指出淮山腋芽、愈傷組織等誘導(dǎo)培養(yǎng)及植株再生， 受品種基因型和培養(yǎng)基中激素配比雙重因素的制約， 品種間對(duì)外源激素有較強(qiáng)的選擇性[23]。

1.6培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件包括溫度、光照、濕度等，是影響組培試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素?；瓷竭m宜溫暖氣候， 25～28 ℃為生長(zhǎng)最適宜溫度，模擬其生長(zhǎng)的最適溫度，使培養(yǎng)室溫度一般為25 ℃，結(jié)果表明在該溫度下組培苗生長(zhǎng)良好。

淮山組織培養(yǎng)受光照條件影響較大， 不同外植體在光、暗條件下愈傷組織的誘導(dǎo)情況不同。李明軍等[12]認(rèn)為， 在暗處有利于零余子的誘導(dǎo)， 而在光下則有利于葉片的誘導(dǎo)。對(duì)零余子和葉片來(lái)說(shuō)， 光下褐化嚴(yán)重， 而在暗處則褐化較輕或無(wú)褐化。堯俊英等[24]研究指出光暗條件不但影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度， 而且影響其形態(tài)建成。

光質(zhì)是組織培養(yǎng)過(guò)程中重要的外部影響因素，主要是作為光信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、分化和代謝。不同光質(zhì)條件下，植物愈傷組織的形成及分化存在一定的差異[25-26]。郭君麗等[27-28]研究不同光質(zhì)對(duì)47號(hào)山藥愈傷組織誘導(dǎo)生長(zhǎng)的影響，認(rèn)為紅光和黃光對(duì)47號(hào)山藥零余子愈傷組織的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而綠光會(huì)抑制生長(zhǎng)；紅光對(duì)47號(hào)懷山藥葉片的愈傷組織的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；有研究表明，白光和紅光有利于促進(jìn)鐵棍山藥試管苗的生根[29]。此外，光質(zhì)不僅影響體外形態(tài)發(fā)生的表達(dá)，而且影響其生理生化特性的變化。郭君麗等[30]研究認(rèn)為，藍(lán)光下47號(hào)懷山藥葉片愈傷組織中的蛋白質(zhì)含量明顯高于其他幾種光質(zhì)，藍(lán)光有利于愈傷組織中可溶性蛋白的形成。根據(jù)諸多報(bào)道認(rèn)為其原因有以下兩方面：一是藍(lán)光促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成；二是藍(lán)光阻止蛋白質(zhì)的喪失[31]。

淮山組織培養(yǎng)還受光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、pH和濕度等培養(yǎng)條件的影響。大部分研究認(rèn)為，淮山較合適的光照強(qiáng)度為1 500～2 500 lx，光照時(shí)數(shù)為10～16 h/d，pH為5.8～6.0，相對(duì)濕度一般要求在70%～80%。

2存在的問(wèn)題

2.1褐化

淮山含有較多的酚類和醌類化合物，在組織培養(yǎng)過(guò)程中，由于外植體組織被切割和接種快繁時(shí)，損傷切面細(xì)胞中酚類物質(zhì)（底物）在酚氧化酶的作用下與氧氣聚合發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒的醌類物質(zhì)，使得外植體切面迅速變成棕褐色或暗褐色，并逐步擴(kuò)散至培養(yǎng)基中，抑制其他酶的活性，導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長(zhǎng)受抑制，甚至最終致使外植體死亡。試驗(yàn)研究認(rèn)為，外植體的生理狀態(tài)和部位、取材時(shí)間和大小、受傷程度及所用消毒劑等對(duì)褐化有一定程度的影響。

目前，克服或減輕淮山組培過(guò)程中褐化的方法主要有以下幾種：一是選擇合適的外植體材料，一般生長(zhǎng)發(fā)育旺盛的培養(yǎng)物， 其褐化程度明顯較小，有研究表明山藥植株后期結(jié)出的零余子褐化程度最嚴(yán)重，而幼嫩節(jié)間部褐化程度較輕[32]；二是在培養(yǎng)基中添加褐變抑制劑與吸附劑，褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑，如抗壞血栓、聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）等[32-33]、吸附劑如活性炭等[34]；三是適時(shí)切除培養(yǎng)物的褐化部分，適時(shí)轉(zhuǎn)接， 提高轉(zhuǎn)接次數(shù)， 隨繼代次數(shù)增多， 使褐化逐漸減輕，從而不影響組織生長(zhǎng)和芽分化[35]。此外，還要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，有研究表明采用液體培養(yǎng)基以及降低培養(yǎng)溫度和光照強(qiáng)度可以有效降低外植體褐變的程度[32]。當(dāng)然， 影響褐變的因素很多， 因此在取材時(shí)， 為了防止褐變的發(fā)生， 要考慮多方面因素的影響。

2.2組培苗移栽成活率低

不同淮山品種之間組培苗移栽成活率差異較大，但總的來(lái)說(shuō)，移栽成活率不高。主要原因是淮山組培苗煉苗之前生長(zhǎng)在培養(yǎng)瓶中，里面的光照、溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)水平、滲透壓等都比較穩(wěn)定，根系的自主吸收能力比較弱，移植后，一旦馴化管理不當(dāng)，根系乃至整株植株一時(shí)適應(yīng)不了外界的環(huán)境條件而導(dǎo)致種苗死亡。因此，為了提高移栽成活率，組培苗首先應(yīng)該在生根階段進(jìn)行壯苗，提高不定根質(zhì)量；其次，在移栽前進(jìn)行煉苗，提高組培苗適應(yīng)環(huán)境的能力；第三，在移植時(shí)，要選擇好適合其生長(zhǎng)的栽培基質(zhì)。相關(guān)的研究指出在淮山組培苗的假植過(guò)程中，園土（CK）較黏重，透氣性不良，根系生長(zhǎng)緩慢，容易死亡，不宜直接移植到大田中，應(yīng)選擇疏松、透氣的基質(zhì)假植，等淮山苗健壯時(shí)，再進(jìn)行定植[36-38]。

3展望

淮山是集加工、醫(yī)藥、保健、食品、蔬菜等于一身的高效經(jīng)濟(jì)作物，發(fā)展淮山產(chǎn)業(yè)，不僅可以有效地提高農(nóng)民收入，而且通過(guò)加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展，還可以更大限度地提高淮山附加值，帶動(dòng)第三產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。尤其是近年來(lái)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)日臻完善，淮山離體培養(yǎng)技術(shù)也得到迅速發(fā)展，這將會(huì)大大提高淮山的育種效率，加快淮山品種改良和產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。同時(shí)可以結(jié)合基因工程將抗病基因轉(zhuǎn)入栽培品種；也可以與分子生物學(xué)方法結(jié)合起來(lái)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行遺傳修飾，重組DNA，從而開辟淮山良種繁育的新途徑。

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