馬世明 羅家佐 王德勛 戶艷霞 范志勇 蘇家恩
摘要 [目的]以煙草β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列為材料,對(duì)其特性進(jìn)行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN篩選蛋白序列,依次運(yùn)用ProtParam、SignalP 4.1和TMHMM 2.0工具進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析煙草葡聚糖酶的理化特性、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的組成成分。[結(jié)果]NtBGl-2的分子量最大(40 390.76 Dk),NtBGl-3的分子量最?。?7 722.64 Dk);NtBGl-1和NtBGl-2的等電點(diǎn)小于7.0,而NtBGl-3的等電點(diǎn)大于7.0;NtBGl-1和NtBGl-2屬于不穩(wěn)定蛋白,NtBGl-3屬于穩(wěn)定性蛋白,且耐熱性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的優(yōu)勢(shì)氨基酸為甘氨酸和絲氨酸,NtBGl-3的為天冬酰氨和丙氨酸;NtBGl均含有信號(hào)肽,屬于分泌蛋白;NtBGl-1無(wú)跨膜區(qū),而NtBGl-2(13 ~35)和NtBGl-3(7 ~29)含有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域,屬于跨膜蛋白。[結(jié)論]該研究為深入研究煙草葡聚糖酶奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 煙草;β-1,3-葡聚糖酶;生物學(xué)
中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2018)17-0096-02
Abstract [Objective] The amino acid sequence of tobacco β1,3glucanase was used as a material to deeply explore its characteristics. [Method]NCBIPROTEIN was used to screen protein sequences, and ProtParam, SignalP 4.1 and TMHMM 2.0 tools were used to predict physicochemical properties, signal peptide and transmembrane structure of tobacco glucan enzyme. [Result]The molecular weight of NtBGl2 was the maximum (40 390.76 Dk), and that of NtBGl3 was the minimum (37 722.64 Dk); the isoelectric point of NtBGl1 and NtBGl2 was less than 7.0, but NtBGl3 was more than 7.0; NtBGl1 and NtBGl2 were unstable proteins, NtBGl3 was a stable protein, and the heat resistance was greater than that of NtBGl1 and NtBGl2; the dominant amino acids of NtBGl1 and NtBGl2 were glycine and serine, NtBGl3 for asparagine and alanine; NtBGl contained signal peptide, belonged to secreted proteins; NtBGl1 had no transmembrane domain, while NtBGl2 (13 ~35) and NtBGl3 (7 ~29) contained transmembrane structure, and belonged to transmembrane proteins.[Conclusion]This study lays the foundation for indepth study of tobacco glucanase.
Key words Tobacco; β 1,3 Glucan; Biology
β-1,3-葡聚糖酶具有水解β型的1,3糖苷鍵的葡聚糖聚合體的作用[1-2],由于葡聚糖是植物細(xì)胞壁的重要組成部分,因此葡聚糖酶具有促進(jìn)植物體軟化的作用[3]。此外,葡聚糖酶具有抵抗部分細(xì)菌和真菌的入侵[4-6]。正常情況下,葡聚糖酶較少在植物體內(nèi)積累,且活性較低,當(dāng)受到病原微生物入侵時(shí),葡聚糖酶的表達(dá)量增加,在體內(nèi)大量合成,同時(shí)產(chǎn)生部分同工酶,進(jìn)而發(fā)揮抵抗病原菌入侵的作用[7-9],如水稻被稻瘟菌感染,誘導(dǎo)葡聚糖酶的活性增加3~5倍[10];煙草的壞疽病感染黃瓜葉,促使葡聚糖酶的活性增加6倍[11]。
目前,關(guān)于煙草葡聚糖酶的研究主要集中在其抵抗病原微生物,主要包括花葉病[12]、疫霉病[13]、立枯絲核菌[14]、壞疽病[11]等。為更深層次地認(rèn)識(shí)煙草β-1,3-葡聚糖酶的生物學(xué)特性,筆者利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行研究,進(jìn)而為深入研究煙草葡聚糖酶奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 篩選煙草β-1,3-葡聚糖酶家族成員
采用NCBI-PROTEIN[15]數(shù)據(jù)庫(kù)在線檢索,篩選煙草葡聚糖酶相關(guān)的蛋白序列,獲取的登錄號(hào)分別是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1,依據(jù)優(yōu)勢(shì)氨基酸和氨基酸數(shù)進(jìn)行命名,分別為NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[16]。
1.2 方法 以ProtParam的工具[17]測(cè)定序列的理化特性,如煙草葡聚糖酶的氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和優(yōu)勢(shì)氨基酸;使用SignalP 4.1的在線服務(wù)[18],其D-cutoff值以Matthews的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行測(cè)定;采用TMHMM 2.0工具[19],根據(jù)疏水性氨基酸,對(duì)煙草葡聚糖酶的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 煙草β-1,3-葡聚糖酶理化特性的分析
通過(guò)在線工具(PROTPARAM)預(yù)測(cè)NtBGl的相關(guān)理化特性,結(jié)果顯示(表1),NtBGl-2的氨基酸數(shù)最多(370),其次是NtBGl-1,為359個(gè),NtBGl-3的最小,含有343個(gè)氨基酸;對(duì)于煙草葡聚糖酶,以NtBGl-2的分子量最大,其分子量為40 390.76 Da,而NtBGl-3的分子量最?。?7 722.64 Da);通過(guò)測(cè)定煙草葡聚糖酶的等電點(diǎn),NtBGl-1和NtBGl-3的等電點(diǎn)分別為6.60和5.12,均屬于酸性蛋白,而NtBGl-2的等電點(diǎn)值最大(7.10),屬于堿性蛋白;NtBGl-1和NtBGl-2的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40,其值分別為42.49和44.28,因此NtBGl-1和NtBGl-2屬于不穩(wěn)定性蛋白,而NtBGl-3的不穩(wěn)定指數(shù)為37.47,即NtBGl-3屬于穩(wěn)定性蛋白;NtBGl-3的脂肪族指數(shù)最大(90.20),說(shuō)明NtBGl-3的耐熱性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的優(yōu)勢(shì)氨基酸相同,均為甘氨酸(含量分別為9.2%、8.9%)和絲氨酸(含量分別為9.2%、9.5%),NtBGl-3的優(yōu)勢(shì)氨基酸為天冬酰氨(9.6%)和丙氨酸(10.2%)。
2.2 煙草β-1,3-葡聚糖酶的信號(hào)肽分析
從信號(hào)肽、原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)3個(gè)方面分析煙草葡聚糖酶的信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)(圖1),NtBGl-1第10位亮氨酸的信號(hào)肽值(S)達(dá)到最大(0.970),而原始的剪切位點(diǎn)(C)和綜合的剪切位點(diǎn)(Y)的最大分值均處于第22位谷氨酰胺,其值分別為0.810和0.856,因此NtBGl-1具有信號(hào)肽,剪切位點(diǎn)處于第21與22位氨基酸之間,信號(hào)肽處于第1~21位的氨基酸,該信號(hào)肽的均值為0.902;NtBGl-2的信號(hào)肽值于第20位亮氨酸處達(dá)到最大(0.957),原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)的最大分值均處于第33位谷氨酰胺,其值分別為0.742和0.795,即NtBGl-2具有信號(hào)肽,剪切位點(diǎn)處于第32~33位氨基酸,信號(hào)肽處于第1~32位的氨基酸,該信號(hào)肽的均值為0.846;NtBGl-3的信號(hào)肽值于第9位苯丙氨酸處達(dá)到最大(0.986),原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)的最大分值均處于第30位谷氨酰胺,其值分別為0.615和0.753,表明NtBGl-3具有信號(hào)肽,剪切位點(diǎn)處于第29與30位氨基酸之間, 且信號(hào)肽處于第1~29位的氨基酸,該信號(hào)肽的均值為0.929。綜上所述,煙草葡聚糖酶均具有信號(hào)肽,即屬于分泌蛋白。
2.3 煙草β-1,3-葡聚糖酶的跨膜結(jié)構(gòu)分析
蛋白酶可通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)錨定于質(zhì)膜上,進(jìn)而在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域參與信號(hào)傳遞或代謝活動(dòng),因此對(duì)NtBGl的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示(圖2),NtBGl-1序列位于膜內(nèi)的氨基酸數(shù)為3.50,小于20.00,即NtBGl-1不具有跨膜結(jié)構(gòu);NtBGl-2和NtBGl-3位于膜內(nèi)序列的氨基酸數(shù)分別為20.97和22.74,均大于20.00,表明NtBGl-2和NtBGl-3含有跨膜結(jié)構(gòu),其概率分別為0.947和0.993;NtBGl-2的第1~12位氨基酸位于
膜內(nèi),第13 ~35位氨基酸為跨膜區(qū),第36~370位的氨基酸處于膜外;NtBGl-3的第1~6位氨基酸位于膜內(nèi),第7~29位氨基酸為跨膜區(qū),第30~343位的氨基酸處于膜外。綜上所述,除NtBGl-1外,NtBGl含有跨膜結(jié)構(gòu)。
3 結(jié)論與討論
通過(guò)理化特性分析,NtBGl-2等電點(diǎn)大于7.0,因此,NtBGl-2可能定位于液泡,且具有降解病原菌菌絲的功能[20],但NtBGl-2屬于不穩(wěn)定性蛋白,因此NtBGl-2可能誘導(dǎo)同工酶、幾丁質(zhì)、核糖體等共同作用,進(jìn)行抵抗病原微生物[7-8];NtBGl均屬于分泌蛋白,具有信號(hào)肽,從而指引煙草葡聚糖酶運(yùn)輸于特定區(qū)域,參與相應(yīng)的抗性反應(yīng)[21];NtBGl-2(第13 ~35位氨基酸)和NtBGl-3(7 ~29)均含有跨膜結(jié)構(gòu),因此,NtBGl-2和NtBGl-3可能參與信號(hào)的傳遞[22]。
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