馬世明 羅家佐 王德勛 戶艷霞 范志勇 蘇家恩
摘要 [目的]以煙草β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列為材料,對其特性進行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN篩選蛋白序列,依次運用ProtParam、SignalP 4.1和TMHMM 2.0工具進行預測并分析煙草葡聚糖酶的理化特性、信號肽和跨膜結構的組成成分。[結果]NtBGl-2的分子量最大(40 390.76 Dk),NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Dk);NtBGl-1和NtBGl-2的等電點小于7.0,而NtBGl-3的等電點大于7.0;NtBGl-1和NtBGl-2屬于不穩(wěn)定蛋白,NtBGl-3屬于穩(wěn)定性蛋白,且耐熱性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的優(yōu)勢氨基酸為甘氨酸和絲氨酸,NtBGl-3的為天冬酰氨和丙氨酸;NtBGl均含有信號肽,屬于分泌蛋白;NtBGl-1無跨膜區(qū),而NtBGl-2(13 ~35)和NtBGl-3(7 ~29)含有跨膜結構區(qū)域,屬于跨膜蛋白。[結論]該研究為深入研究煙草葡聚糖酶奠定基礎。
關鍵詞 煙草;β-1,3-葡聚糖酶;生物學
中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611(2018)17-0096-02
Abstract [Objective] The amino acid sequence of tobacco β1,3glucanase was used as a material to deeply explore its characteristics. [Method]NCBIPROTEIN was used to screen protein sequences, and ProtParam, SignalP 4.1 and TMHMM 2.0 tools were used to predict physicochemical properties, signal peptide and transmembrane structure of tobacco glucan enzyme. [Result]The molecular weight of NtBGl2 was the maximum (40 390.76 Dk), and that of NtBGl3 was the minimum (37 722.64 Dk); the isoelectric point of NtBGl1 and NtBGl2 was less than 7.0, but NtBGl3 was more than 7.0; NtBGl1 and NtBGl2 were unstable proteins, NtBGl3 was a stable protein, and the heat resistance was greater than that of NtBGl1 and NtBGl2; the dominant amino acids of NtBGl1 and NtBGl2 were glycine and serine, NtBGl3 for asparagine and alanine; NtBGl contained signal peptide, belonged to secreted proteins; NtBGl1 had no transmembrane domain, while NtBGl2 (13 ~35) and NtBGl3 (7 ~29) contained transmembrane structure, and belonged to transmembrane proteins.[Conclusion]This study lays the foundation for indepth study of tobacco glucanase.
Key words Tobacco; β 1,3 Glucan; Biology
β-1,3-葡聚糖酶具有水解β型的1,3糖苷鍵的葡聚糖聚合體的作用[1-2],由于葡聚糖是植物細胞壁的重要組成部分,因此葡聚糖酶具有促進植物體軟化的作用[3]。此外,葡聚糖酶具有抵抗部分細菌和真菌的入侵[4-6]。正常情況下,葡聚糖酶較少在植物體內積累,且活性較低,當受到病原微生物入侵時,葡聚糖酶的表達量增加,在體內大量合成,同時產(chǎn)生部分同工酶,進而發(fā)揮抵抗病原菌入侵的作用[7-9],如水稻被稻瘟菌感染,誘導葡聚糖酶的活性增加3~5倍[10];煙草的壞疽病感染黃瓜葉,促使葡聚糖酶的活性增加6倍[11]。
目前,關于煙草葡聚糖酶的研究主要集中在其抵抗病原微生物,主要包括花葉病[12]、疫霉病[13]、立枯絲核菌[14]、壞疽病[11]等。為更深層次地認識煙草β-1,3-葡聚糖酶的生物學特性,筆者利用生物信息學的方法進行研究,進而為深入研究煙草葡聚糖酶奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 篩選煙草β-1,3-葡聚糖酶家族成員
采用NCBI-PROTEIN[15]數(shù)據(jù)庫在線檢索,篩選煙草葡聚糖酶相關的蛋白序列,獲取的登錄號分別是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1,依據(jù)優(yōu)勢氨基酸和氨基酸數(shù)進行命名,分別為NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[16]。
1.2 方法 以ProtParam的工具[17]測定序列的理化特性,如煙草葡聚糖酶的氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和優(yōu)勢氨基酸;使用SignalP 4.1的在線服務[18],其D-cutoff值以Matthews的相關系數(shù)進行測定;采用TMHMM 2.0工具[19],根據(jù)疏水性氨基酸,對煙草葡聚糖酶的跨膜結構進行分析。
2 結果與分析
2.1 煙草β-1,3-葡聚糖酶理化特性的分析
通過在線工具(PROTPARAM)預測NtBGl的相關理化特性,結果顯示(表1),NtBGl-2的氨基酸數(shù)最多(370),其次是NtBGl-1,為359個,NtBGl-3的最小,含有343個氨基酸;對于煙草葡聚糖酶,以NtBGl-2的分子量最大,其分子量為40 390.76 Da,而NtBGl-3的分子量最?。?7 722.64 Da);通過測定煙草葡聚糖酶的等電點,NtBGl-1和NtBGl-3的等電點分別為6.60和5.12,均屬于酸性蛋白,而NtBGl-2的等電點值最大(7.10),屬于堿性蛋白;NtBGl-1和NtBGl-2的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40,其值分別為42.49和44.28,因此NtBGl-1和NtBGl-2屬于不穩(wěn)定性蛋白,而NtBGl-3的不穩(wěn)定指數(shù)為37.47,即NtBGl-3屬于穩(wěn)定性蛋白;NtBGl-3的脂肪族指數(shù)最大(90.20),說明NtBGl-3的耐熱性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的優(yōu)勢氨基酸相同,均為甘氨酸(含量分別為9.2%、8.9%)和絲氨酸(含量分別為9.2%、9.5%),NtBGl-3的優(yōu)勢氨基酸為天冬酰氨(9.6%)和丙氨酸(10.2%)。
2.2 煙草β-1,3-葡聚糖酶的信號肽分析
從信號肽、原始的剪切位點和綜合的剪切位點3個方面分析煙草葡聚糖酶的信號肽發(fā)現(xiàn)(圖1),NtBGl-1第10位亮氨酸的信號肽值(S)達到最大(0.970),而原始的剪切位點(C)和綜合的剪切位點(Y)的最大分值均處于第22位谷氨酰胺,其值分別為0.810和0.856,因此NtBGl-1具有信號肽,剪切位點處于第21與22位氨基酸之間,信號肽處于第1~21位的氨基酸,該信號肽的均值為0.902;NtBGl-2的信號肽值于第20位亮氨酸處達到最大(0.957),原始的剪切位點和綜合的剪切位點的最大分值均處于第33位谷氨酰胺,其值分別為0.742和0.795,即NtBGl-2具有信號肽,剪切位點處于第32~33位氨基酸,信號肽處于第1~32位的氨基酸,該信號肽的均值為0.846;NtBGl-3的信號肽值于第9位苯丙氨酸處達到最大(0.986),原始的剪切位點和綜合的剪切位點的最大分值均處于第30位谷氨酰胺,其值分別為0.615和0.753,表明NtBGl-3具有信號肽,剪切位點處于第29與30位氨基酸之間, 且信號肽處于第1~29位的氨基酸,該信號肽的均值為0.929。綜上所述,煙草葡聚糖酶均具有信號肽,即屬于分泌蛋白。
2.3 煙草β-1,3-葡聚糖酶的跨膜結構分析
蛋白酶可通過跨膜結構錨定于質膜上,進而在亞細胞結構的特定區(qū)域參與信號傳遞或代謝活動,因此對NtBGl的跨膜結構進行分析,結果顯示(圖2),NtBGl-1序列位于膜內的氨基酸數(shù)為3.50,小于20.00,即NtBGl-1不具有跨膜結構;NtBGl-2和NtBGl-3位于膜內序列的氨基酸數(shù)分別為20.97和22.74,均大于20.00,表明NtBGl-2和NtBGl-3含有跨膜結構,其概率分別為0.947和0.993;NtBGl-2的第1~12位氨基酸位于
膜內,第13 ~35位氨基酸為跨膜區(qū),第36~370位的氨基酸處于膜外;NtBGl-3的第1~6位氨基酸位于膜內,第7~29位氨基酸為跨膜區(qū),第30~343位的氨基酸處于膜外。綜上所述,除NtBGl-1外,NtBGl含有跨膜結構。
3 結論與討論
通過理化特性分析,NtBGl-2等電點大于7.0,因此,NtBGl-2可能定位于液泡,且具有降解病原菌菌絲的功能[20],但NtBGl-2屬于不穩(wěn)定性蛋白,因此NtBGl-2可能誘導同工酶、幾丁質、核糖體等共同作用,進行抵抗病原微生物[7-8];NtBGl均屬于分泌蛋白,具有信號肽,從而指引煙草葡聚糖酶運輸于特定區(qū)域,參與相應的抗性反應[21];NtBGl-2(第13 ~35位氨基酸)和NtBGl-3(7 ~29)均含有跨膜結構,因此,NtBGl-2和NtBGl-3可能參與信號的傳遞[22]。
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