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        高效液相色譜法測定小葉女貞果實中山柰酚的含量

        2018-05-14 17:05:55楊亞熹郭向群
        農(nóng)村經(jīng)濟與科技 2018年23期
        關鍵詞:含量測定高效液相色譜法

        楊亞熹 郭向群

        [摘要]目的:研究小葉女貞果實中山柰酚的酸水解提取條件,建立高效液相色譜法測定小葉女貞果實中的山柰酚含量的方法,并分析不同來源藥材中山柰酚的含量差異。方法:小葉女貞果實經(jīng)體積分數(shù)為 20%的鹽酸-甲醇溶液(1:4)水解提取后,用高效液相色譜法測定其水解液中的山柰酚的含量。以Inertsil ODS-SP(5μm,250×4.6mm)色譜柱,乙腈- 0.3%磷酸水溶液(37:63)為流動相進行等度洗脫,流速為 1.000ml/min,檢測波長為 370nm;柱溫為35℃。結果:實驗的方法學考察結果表明,山柰酚進樣量在 0.192~1.152μg范圍內(nèi)的峰面積與吸光度有良好線性關系,其回歸方程為y=5E+06x+18.723,r=0.9998;平均回收率為 98.64%(RSD%=1.89,n=6);在此測定條件下穩(wěn)定性試驗的RSD為 1.52%,樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,重復性試驗的RSD為 1.42%,該測定方法的重現(xiàn)性較好;9批不同來源小葉女貞果實樣品中山柰酚含量有一定差異,平均含量為0.3506mg/g,RSD為0.18%。結論:酸水解提取-高效液相色譜法可用于小葉女貞果實中山柰酚的含量測定。

        [關鍵詞]高效液相色譜法;小葉女貞果實;山柰酚;含量測定

        [中圖分類號]R284.1[文獻標識碼]A

        小葉女貞(Ligustrum quihoni Carr.)又名小葉冬青,在全國各地均有分布,資源豐富。其根葉可入藥,具有清熱解毒的功效,可治療外傷、燙傷等癥。經(jīng)文獻檢索和資料查閱,該植物果實的藥用未發(fā)現(xiàn)有文獻記載。據(jù)文獻報道小葉女貞中含有齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚及揮發(fā)油等化合物;其提取物具有免疫調(diào)節(jié)、止咳平喘及清除自由基的作用;山柰酚的抗菌、抗病毒、抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、對動脈粥樣硬化及糖尿病的防治作用備受關注。小葉女貞果實中山柰酚至今尚未見有含量測定的報道。本實驗建立了HPLC測定小葉女貞果實中山柰酚的方法,該方法簡便易行、結果準確、重復性好。

        1 實驗材料

        1.1 儀器

        LC-20A色譜儀(島津),SPD-M20A二極管陣列檢測器(島津);MS105型分析天平(梅特勒-托得多儀器有限公司);K-Q500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TG16-WS臺式高速離心機(鄭州宏朗儀器設備有限公司);DZKW-4電子恒溫水浴鍋(上??莆鲈囼瀮x器廠)。

        1.2 藥品及試劑

        山柰酚對照品(批號為ST0105,上海如吉生物科技);乙腈為色譜純(德國默克公司),其余所用試劑均為分析純。

        1.3 藥材

        藥材9批,于冬至前采集,經(jīng)天然藥物教研室陸鴻奎副教授鑒定為木犀科女貞屬植物小葉女貞(Ligustrum quihoni Carr.)的果實。

        2 方法與結果

        2.1 對照品溶液的制備

        取山柰酚對照品適量,精密稱定,用甲醇溶解制成每1ml含山柰酚0.0960mg的對照品溶液,即得。

        2.2 供試品溶液制備

        取藥材樣品粗粉(過2號篩)1g,精密稱定,用石油醚50ml回流1小時,藥渣揮干石油醚后,加入20%鹽酸溶液15ml,乙酸乙酯60ml水浴回流提取1小時,濾過,濾液用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH5~6后于水浴濃縮至干。殘渣用甲醇溶解,于15000r/min離心10min,定容為50ml,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作樣品溶液。

        2.3 色譜條件

        用Inertsil ODS-SP(5μm,250×4.6mm)色譜柱,在370nm波長、35℃柱溫條件下,進樣10μl,流速為1.000ml/min,以乙腈-0.3%磷酸水溶液(37:63)為流動相進行洗脫。

        2.4 系統(tǒng)適應性試驗

        分別精密吸取2.1和2.2 項下制備的對照品和供試品溶液各10μl,按2.3 色譜條件項下色譜條件進行測定,記錄色譜圖,色譜圖見圖1。結果,供試品中山柰酚色譜峰的保留時間為9.09,與對照品溶液一致,分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)不低于4 000,溶劑空白無干擾。色譜圖見圖 1。

        2.5 線性關系考察

        按2.3色譜條件項下方法,精密吸取2.1項下的對照品溶液1,2,3,4,5,6,12μl,分別注入液相色譜儀,測得山柰酚面積的回歸方程為y=5E+06x+ 18.723,r=0.9998。以進樣量為橫坐標,峰面積為縱坐標作圖,在上述色譜條件下,山柰酚進樣量在0.096~1.152μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關系良好。山柰酚線性關系見圖2。

        2.6 精密度試驗

        分別吸取2.1項下的對照品溶液10μl,按2.3項下色譜條件測定6次,其峰面積RSD 為1.63%,表明儀器精密度良好。

        2.7 穩(wěn)定性試驗

        取同一批藥材(采于楚雄醫(yī)專校園內(nèi)的藥材),按2.2項下方法制備供試品溶液,分別于配制后 0,2,4,8,12,24h 進樣10μl,測得山柰酚的峰面積RSD為 1.52%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.8 重復性試驗

        取同一批藥材粗粉(過2號篩)6 份,精密稱定,按2.2項下方法制備供試品溶液,精密吸取各10μl注入高效液相色譜儀,按2.3項下色譜條件進行含量分析,山柰酚質(zhì)量分數(shù)的RSD為 1.42%,表明該測定方法的重復性良好。

        2.9 加樣回收率試驗

        取已知山柰酚含量的藥材粗粉(過2號篩)6份,精密稱定,每份約2g,分別加入山柰酚對照品適量,按2.2項下方法制備供試品溶液,測得山柰酚的平均回收率為98.64%(n=6),RSD=1.89,結果見表1。

        2.10 樣品測定

        取藥材樣品粗粉(過2號篩)1 g,精密稱定,按2.2項下方法制備供試品溶液,精密吸取10μl,按 2.3項下色譜條件進行測定,記錄峰面積,計算山柰酚含量。同法測定9批樣品(批號見表2),每批樣品平行測定三次,其測定結果的平均值見表2。

        3 討論

        在提取條件的選擇中,為藥材中的山柰酚由苷水解為游離狀態(tài),常在提取溶劑中加入一定量的酸進行水解。筆者考察了甲醇-2%鹽酸、乙醇-2%鹽酸、乙酸乙酯-2%鹽酸等為提取溶劑進行回流和超聲提取,結果顯示,以乙酸乙酯-2%鹽酸(4:1)為溶劑進行超聲提取效果最佳。

        洗脫劑的選擇,考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸水溶液的等度和梯度洗脫的情況,最終選擇用乙腈-0.3%磷酸(37:63)洗脫進行等度洗脫分離較好。用二極管陣列檢測器對山柰酚用上述條件在波長200~400nm繪出3D圖譜,結果山柰酚于370nm波長處的HPLC色譜響應較大,同時各色譜峰分離度較好,故選擇370nm為檢測波長。

        建立的方法穩(wěn)定性、回收率、重復性和分離效果較好,能快速、準確地測定小葉女貞果實中山柰酚的含量,可用于小葉女貞果實中山柰酚的含量測定。

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