郄亞微

摘 要 為實現(xiàn)白芨的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)，以白芨的成熟蒴果為材料，在MS、1/2MS添加6-BA的培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌播種。將種子萌發(fā)后形成的原球莖接種到不同培養(yǎng)基上進(jìn)行擴增繁殖，建立白芨無性繁殖體系。結(jié)果表明：種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0 mg·L-1，它能有效提高萌發(fā)率，促進(jìn)原球莖的生長；無性繁殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。此體系的建立有助于白芨的相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)化。

關(guān)鍵詞 白芨；種子萌發(fā)；無性繁殖體系

中圖分類號：S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.29.094

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]是蘭科白芨屬多年生草本植物，極具經(jīng)濟價值。其塊莖為我國傳統(tǒng)名貴的中藥，有收斂止血、消腫生肌的功能，可治咳血吐血、外傷出血、潰瘍病出血、肺結(jié)核吐血、瘡瘍腫毒等疾病，同時花色艷麗，也是一種觀賞極佳的景觀植物。

白芨分布較廣，在全國大部分省區(qū)均有分布，主產(chǎn)于四川、貴州、湖南、湖北、安徽、江蘇、河南、云南、廣西和浙江等省區(qū)。在野生狀態(tài)下，白芨種子的自然萌發(fā)率極低，繁殖困難，只能依靠人工繁育來提高白芨產(chǎn)量。現(xiàn)在人工繁育的常規(guī)方法以分株為主，即將塊莖分切成小塊種植，但繁殖系數(shù)低、消耗量大，當(dāng)發(fā)展大面積、規(guī)?；a(chǎn)時，供種困難。另因生境遭受破壞和無序采挖，白芨野生資源嚴(yán)重匱乏，已被國家列為珍稀瀕危植物。為滿足市場對白芨藥材的需求，保護(hù)野生白芨資源，利用組織培養(yǎng)方法構(gòu)建白芨快速繁殖體系勢在必行。本研究以白芨種子為起點，試圖建立一套經(jīng)濟可靠的白芨組織培養(yǎng)體系，為實現(xiàn)白芨的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為成熟未開裂的野生白芨蒴果，采于四川省廣安市廣安區(qū)崇望鄉(xiāng)自力村山谷，地理坐標(biāo)為東經(jīng)106°38′、北緯30°35′，海拔410 m，中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫暖，熱量充足，雨量豐沛，空氣濕度大，日照少，霜期短，土壤類型為棕壤，pH值為6.7。

試驗材料由廣安新天地農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司高級農(nóng)藝師馬曉彬鑒定。

1.2 方法

1.2.1 無菌播種

選取成熟未裂蒴果，用毛筆輕輕掃去附著在其表面的灰塵，流水洗凈，在超凈臺內(nèi)進(jìn)行消毒處理，先用75%的醫(yī)用酒精表面消毒30s，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒10 min，無菌水沖洗5～6次，置于無菌濾紙上吸干表面水分。在無菌條件下，用手術(shù)刀縱向剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子均勻播種于培養(yǎng)基。播種后先將培養(yǎng)基置于暗條件下培養(yǎng)，種子萌發(fā)后再移至光照條件下，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間10 h·d-1，光照強度1 500～2 000 lx?；九囵B(yǎng)基采用MS、1/2MS的大量元素，每類基本培養(yǎng)基又分別添加6-BA濃度0 mg·L-1、

0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1。所有培養(yǎng)基均添加3%的蔗糖及0.6%的瓊脂，pH值調(diào)至5.8。每個處理接種

5瓶，每瓶種子約為200粒，培養(yǎng)35天后，統(tǒng)計白芨種子的萌發(fā)率。

1.2.2 無性繁殖體系構(gòu)建

種子萌發(fā)形成原球莖后，將原球莖轉(zhuǎn)接到無性繁殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同激素6-BA和NAA的組合配比，6-BA濃度設(shè)置三水平（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1），NAA濃度設(shè)置三水平（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1），完全隨機設(shè)計共9個處理，添加3%蔗糖及0.6%的瓊脂，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間10 h·d-1，

光照強度1 500～2 000 lx。每個處理接種10瓶，培養(yǎng)35天后，觀察原球莖的生長狀況和調(diào)查原球莖繼代增殖

數(shù)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芨種子無菌萌發(fā)

黑暗培養(yǎng)10天后，在培養(yǎng)基中可觀察到有少數(shù)種胚膨大，繼而突破種皮開始萌發(fā)；轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后，種子開始顏色變綠，并有原球莖發(fā)育。白芨種子呈粉末狀，解剖鏡下觀察，種子呈紡錘形，結(jié)構(gòu)簡單，由一層透明的種皮和1個種胚組成。白芨種子在自然條件下發(fā)芽率很低，影響其萌發(fā)的因素很多，有種皮的機械阻力和透水性差、種胚發(fā)育不全、貯存的營養(yǎng)物質(zhì)過少以及可能存在抑制物質(zhì)等。

2.2 基本培養(yǎng)基對白芨種子萌發(fā)的影響

接種10天后，兩種基本培養(yǎng)基中的種子均有萌發(fā)。由表1可知，各處理中種子的萌發(fā)率以1/2MS培養(yǎng)基最佳。方差分析表明，培養(yǎng)基對種子萌發(fā)率的影響及其顯著，采用1/2MS培養(yǎng)基，平均萌發(fā)率為74.73%，顯著高于MS培養(yǎng)基，這也說明成熟種子的胚自身貯藏的營養(yǎng)可以滿足種子萌發(fā)的需求。從種子萌發(fā)后幼苗生長情況看，1/2MS培養(yǎng)基處理后幼苗生長在整齊程度、高度、顏色等方面略優(yōu)于MS培養(yǎng)基處理。

2.3 6-BA濃度對白芨種子萌發(fā)率的影響

由表1可知，處理7的種子萌發(fā)率最高，高達(dá)89.2%，且萌發(fā)后幼苗芽整齊，較粗壯，高約0.8 cm，顏色濃綠，部分有根毛長出。當(dāng)6-BA濃度分別為0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、

1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1時，平均萌發(fā)率為58.15%、67.50%、79.45%、64.25%。通過多重比較，采用6-BA濃度1.0 mg·L-1時顯著高于其他濃度水平，其他濃度水平之間差異不顯著。故6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，即為白芨種子萌發(fā)的最適濃度。

2.4 不同激素處理對白芨繼代培養(yǎng)的影響

將原球莖轉(zhuǎn)入擴繁培養(yǎng)基培養(yǎng)35天后，不同培養(yǎng)基中原球莖的增殖率及原球莖繼代增殖倍數(shù)見表2。在培養(yǎng)基處理D中，原球莖增殖率達(dá)81.2%，增殖倍數(shù)達(dá)到3.7，為最高增殖倍數(shù)，且觀察到原球莖顆粒飽滿、狀態(tài)良好，呈濃綠色，無分化現(xiàn)象，優(yōu)于其他處理組合。即可篩選出MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1為最佳擴增繁殖培養(yǎng)基。實驗中也發(fā)現(xiàn)原球莖增殖率較小的激素組合，原球莖會萌發(fā)形成幼苗。因此，在擴繁培養(yǎng)中，如將激素組合設(shè)定為6-BA1.0 mg·L-1+NAA

0.1 mg·L-1，可大量擴增原球莖；如將激素組合調(diào)整為6-BA1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1，則利于植株生長，可獲得白芨幼苗。

3 小結(jié)與討論

1）選用大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基作為種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基，其鹽分較低，有利于萌發(fā)，白芨種子的萌發(fā)率均達(dá)51.6%以上，最高可達(dá)79.2%。少數(shù)種子未能萌發(fā)的原因可能是在培養(yǎng)基中吸水分不足或胚的結(jié)構(gòu)不完整。張建霞等[1]發(fā)現(xiàn)，白芨種子的有胚率與蒴果的胚齡有關(guān)，胚齡越長，有胚率越高。本試驗所用的材料采集于野外，白芨蒴果已經(jīng)成熟但未開裂，故有胚率較高，萌發(fā)率較高。

2）在無菌播種試驗中，培養(yǎng)基均添加了單一激素6-BA，并設(shè)計了濃度梯度0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、

1.5 mg·L-1，結(jié)果表明：6-BA濃度為1.0 mg·L-1時種子萌發(fā)率最高，這與袁寧[2]、王楷[3]等的結(jié)果相似。此外，添加活性炭可以為培養(yǎng)提供暗環(huán)境，更有易于種子萌發(fā)及幼苗生長，添加濃度以0.1%為宜。

3）不同植物激素濃度及配比與原球莖的增殖有很大關(guān)系，原球莖的繼代增殖需要濃度適宜的植物生長素和細(xì)胞分裂素共同作用。在原球莖擴增繁殖試驗中，設(shè)計三個濃度（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）的6-BA和三個濃度（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1）的NAA進(jìn)行組合配比，經(jīng)過試驗選出最適宜原球莖繁殖的培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。本試驗結(jié)果中處理F：6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為1.0 mg·L-1利于植株生長，可獲得幼苗，為理想的生長培養(yǎng)基。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關(guān)系[J].亞熱帶植物科學(xué)，2005，34（4）：32-35.

[2] 袁寧.白芨組織培養(yǎng)技術(shù)體系研究[D].成都：西南交通大學(xué)，2008.

[3] 王楷，李玥，張云峰，等.白芨種子高效萌發(fā)及其無性繁殖體系的構(gòu)建[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)報，2006，21（2）：160-163.

（責(zé)任編輯：劉昀）