周琳

摘 要：最近的研究表明，母豬在第一胎中未被仔豬吮吸利用的乳頭在第二胎中會(huì)發(fā)育不良且泌乳量下降。本研究將研究在首個(gè)泌乳期中母豬乳頭分別吮吸2 d、7 d和21 d對(duì)第二胎中所產(chǎn)仔豬生長(zhǎng)性能、乳成分、母豬內(nèi)分泌和乳腺組織基因表達(dá)的影響。妊娠的頭胎大白母豬根據(jù)泌乳期分為3組：1） 泌乳期2 d（組號(hào)“2D組”，母豬20頭）；2） 泌乳期7 d（組號(hào)“7D組”，母豬20頭）；3） 泌乳期21 d（組號(hào)“21D組”，母豬21頭）。斷奶后，母豬正常飼養(yǎng)直至第二胎。在這兩個(gè)胎次的泌乳期內(nèi)，每頭母豬的帶仔數(shù)均調(diào)整為12頭和12個(gè)功能乳頭，多余的乳頭封印處理。在第二胎的泌乳期內(nèi)，記錄母豬的采食量，同時(shí)在出生后第2、7、14、21、31和56天分別對(duì)仔豬稱重。在第二胎妊娠的第110天和泌乳期的第21天，每個(gè)處理組取10頭母豬的乳腺薄壁活體組織檢測(cè)PRL、PRLR-LF、STAT5A、STAT5B、LALBA和IGFBP-5基因mRNA豐度，同時(shí)采集乳汁和頸靜脈血液樣本，分析乳的標(biāo)準(zhǔn)組成成分（干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖），測(cè)定血液中催乳素、IGF-1、葡萄糖和尿素濃度。結(jié)果表明，在第二胎泌乳期的第1周，與2D組和7D組母豬相比，21D組母豬采食量有升高的趨勢(shì) （P<0.10）；在第56天之前，不同處理組在仔豬體重及母豬乳汁的干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖含量上均無(wú)顯著的差異（P>0.10）。在第二胎泌乳期的第110天，21D組母豬乳腺組織的PRL表達(dá)水平高于7D組的母豬；在第21天，7D組母豬乳腺組織STAT5B的表達(dá)水平高于2D組的母豬（P<0.05），而IGFBP-5的表達(dá)水平往往低于后者（P<0.10）；2D組母豬乳腺組織LALBA的表達(dá)水平低于7D組母豬。本文研究結(jié)果表明，母豬首個(gè)泌乳期期乳頭被仔豬吮吸時(shí)間從2 d增加到7 d或21 d不會(huì)影響其第二胎所吮吸仔豬的生長(zhǎng)速度。這說(shuō)明在第一胎中讓母豬乳頭接受2 d的仔豬吮吸足以確保母豬乳腺的良好發(fā)育。

關(guān)鍵詞：基因表達(dá)；泌乳期；泌乳量；胎次；母豬；乳頭吮吸

中圖分類號(hào)：S814.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2018）04-0037-06

決定哺乳仔豬生長(zhǎng)速度的主要因素是它們攝入的母乳量，而母豬的泌乳量又受制于啟動(dòng)泌乳時(shí)乳腺中乳腺細(xì)胞的數(shù)量（Head和Williams，1991）。妊娠的最后三分之一時(shí)間是母豬乳腺快速發(fā)育的階段（S?rensen等，2002），這種發(fā)育在整個(gè)泌乳期會(huì)一直持續(xù)。有報(bào)道稱，哺乳仔豬從哺乳期的第5天到第21天，其體重平均提高57%（Kim等，1999）。在仔豬斷奶后，母豬乳腺快速萎縮，進(jìn)而退化到休眠狀態(tài)（Monks等，2002）。在斷奶后的7 d中，母豬乳腺實(shí)質(zhì)組織重量會(huì)減少三分之二以上（Ford等，2003）。萎縮后，乳腺組織會(huì)在下一胎的妊娠期再次發(fā)育。

仔豬的吮吸對(duì)乳腺組織維持泌乳功能極為重要（Farme，2013），否則乳腺組織在泌乳期間也會(huì)發(fā)生萎縮（Theil等，2006）。這種萎縮在 3 d后是不可逆的，且會(huì)引起乳腺基因表達(dá)的改變。最新的研究表明，在第一胎泌乳期間未被仔豬吮吸利用的乳頭在第二胎中會(huì)出現(xiàn)發(fā)育不良且泌乳量下降。吮吸第一胎被用過(guò)乳頭的仔豬在56日齡時(shí)體重比吮吸早先未被用過(guò)乳頭的仔豬重1.12 kg（Farmer等，2012）。該最近的研究還證明，頭胎期間被吮吸過(guò)的乳頭其乳腺實(shí)質(zhì)組織中催乳素mRNA相對(duì)豐度有增高的趨勢(shì)。但仍有部分問(wèn)題留有疑問(wèn)：頭胎時(shí)乳頭最短需要吮吸多長(zhǎng)時(shí)間才不會(huì)影響該乳頭在第二胎的泌乳量？本研究的目的是明確頭胎期間母豬乳頭分別接受2 d、7 d和21 d的吮吸時(shí)間對(duì)第二胎中的仔豬生長(zhǎng)性能、內(nèi)分泌狀態(tài)和母豬乳腺組織基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)?zāi)肛i和分組

試驗(yàn)選擇有14個(gè)功能性乳頭的61頭初產(chǎn)大白母豬，用長(zhǎng)白公豬精液實(shí)施人工授精，飼喂至分娩。隨后根據(jù)泌乳期長(zhǎng)短，61頭母豬隨機(jī)分為3組：（1） 泌乳期2 d（ 組號(hào)“2D 組”，母豬20 頭）；2） 泌乳期7 d（ 組號(hào)“7D 組”，母豬20 頭）；3） 泌乳期21 d（ 組號(hào)“21D 組”，母豬21 頭）。斷奶后，母豬按照正常生產(chǎn)流程飼養(yǎng)至第二胎分娩。在兩個(gè)胎次的泌乳期間，各母豬的帶仔頭數(shù)于分娩后12 h內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化到12頭（根據(jù)平均窩重調(diào)整）。在標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，第一胎每頭仔豬只允許吮吸1個(gè)乳頭，剩余乳頭用膠帶封隔。在第二胎的泌乳期內(nèi)中，第一胎中封隔的乳頭依舊封隔，且也不增加封隔的乳頭，即使有仔豬死亡也如此。在第二胎的泌乳期內(nèi)，仔豬在出生后48 h（窩仔豬數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后）、第7天、第14天和第21天（斷奶）、第31天和第56天分別稱重。仔豬在斷奶前不補(bǔ)充教槽料以保證其增重真實(shí)反映了母豬的泌乳量，記錄斷奶前的死亡率。在第二胎泌乳期的第21天，先將母豬與仔豬隔離45 min后，再給母豬靜脈注射1.0 mL催產(chǎn)素，隨后分別選定前、中、后三個(gè)有正常泌乳功能的乳頭人工擠奶收集豬乳樣本，測(cè)定乳中的干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖含量；同時(shí)取所有母豬的頸靜脈血液樣本，測(cè)定催乳素、胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin Like Growth Factor 1，IGF-1）、葡萄糖和尿素的濃度。

在兩個(gè)妊娠期中，母豬均飼喂常規(guī)的玉米-豆粕型商品日糧，其中粗蛋白14.3%、消化能3 266 kcal/kg、賴氨酸0.75%。頭胎母豬飼喂量為2.5 kg/d，二胎母豬飼喂量為3.0 kg/d，每天07：00飼喂1次。在兩個(gè)哺乳期中，母豬飼喂常規(guī)的玉米-豆粕型商品日糧，其中粗蛋白17.6%、消化能3 459 kcal/kg、賴氨酸1.0%，每天09：00飼喂1次。母豬在分娩當(dāng)天飼喂3 kg日糧，從分娩后第2天至斷奶期間實(shí)行自由采食。在第二胎的泌乳期，每天對(duì)余料進(jìn)行稱重以計(jì)算采食量。第一胎的母豬從斷奶至配種期間自由采食相同的哺乳期飼料，哺乳母豬于妊娠期第110天轉(zhuǎn)入周轉(zhuǎn)性分娩欄內(nèi)（1.8 m×2.4 m）。斷奶時(shí)，同窩仔豬整體飼養(yǎng)在1.2 m×3.0 m的欄內(nèi)直至56日齡，期間飼喂4種商品日糧（表1），自由采食與飲水。實(shí)驗(yàn)日期從2013年10月至2015年4月。

1.2 血液樣本處理與檢測(cè)

在早上喂料前采集頸靜脈血，以測(cè)定催乳素、IGF-1、葡萄糖和尿素的濃度。催乳素濃度測(cè)定參照Robert等（1989）的方法進(jìn)行。直接購(gòu)買標(biāo)記的催乳素和催乳素的一抗抗體，檢測(cè)前確認(rèn)哺乳母豬混合血液樣本的有效性，平行性和平均回質(zhì)率均為98.3%，檢測(cè)靈敏度為1.5 ng/mL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為4.47%和2.79%。購(gòu)買人用IGF-1濃度檢測(cè)盒，檢測(cè)靈敏度為0.10 ng/mL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為4.58%和1.17%。采用商品試劑盒的酶解比色法檢測(cè)葡萄糖，組內(nèi)好組間變異系數(shù)分別為1.32%和0.42%。尿素測(cè)定參照Huntington等（1984）的方法使用自動(dòng)分析儀用比色法測(cè)定，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為2.58%和0.46%。

測(cè)定全奶的干物質(zhì)、蛋白、脂肪和乳糖含量。干物質(zhì)測(cè)定采用送風(fēng)定溫干燥法；蛋白采用微量凱氏定氮法重復(fù)測(cè)定；脂肪采用乙醚萃取法提?。蝗樘抢蒙虡I(yè)試劑盒以比色法測(cè)定。組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為1.38%和0.71%。

1.3 乳腺活組織檢查

在第二胎的妊娠期第110天和哺乳期第21天，采集10頭母豬的功能性乳腺的薄壁組織樣本。乳腺活組織樣本檢查參照Kirkwood等（2007）的方法，與之不同的環(huán)節(jié)是母豬通過(guò) 8 mL～10 mL的麻醉預(yù)混劑和15 mL氮哌酮麻醉處理，然后每個(gè)乳頭采集50 mg組織樣本?；罱M織樣本置于含有1 mL RNAlater的2 mL管內(nèi)，4 ℃放置過(guò)夜，再于-80 ℃凍存后測(cè)定催乳素（PRL）、催乳素長(zhǎng)型受體（PRLR-LF）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT5A和STAT5B）、α-乳白蛋白（LAIBA）和IGFBP-5的基因豐度。

1.4 RNA提取、DNA合成以及選定基因的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增

50 mg乳腺組織置于1 mL peq GOLD TriFast內(nèi)，采用1.0 mm玻璃珠勻漿處理，總RNA根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)用Direct-zolRNA miniPrep試劑盒提取。RNA數(shù)量和純度分別在260 nm和280 nm吸收光波下用NanoDrop ND 2000分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。cDNA反轉(zhuǎn)錄體系含0.25 μg總RNA、M-MLV反轉(zhuǎn)錄RNAaseH-、點(diǎn)突變和隨機(jī)六聚體引物。mRNA豐度以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）測(cè)定，反應(yīng)體系含有SensiMix SYBR-Green、5 pmol正向引物和5 pmol反向引物。其中看家（內(nèi)參）基因（GAPDH和泛素）和待檢測(cè)靶基因均根據(jù)之前報(bào)道序列（PRL、PRLR-LF、LAIBA和IGFBP-5）人工合成。以Rotor Gene 軟件進(jìn)行閾值分析，靶基因表達(dá)以內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，其公式如下：△Ct=Ct靶基因 - Ct內(nèi)源對(duì)照（各個(gè)內(nèi)參基因的平均Ct值）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中的MIXED程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中激素和代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)以及乳成分和實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，包括處理效應(yīng)和殘差分析。重復(fù)測(cè)量方差分析，包括處理組內(nèi)誤差（相同處理組內(nèi)母豬間的誤差）和天數(shù)（殘差誤差）以及處理組×天數(shù)對(duì)采食量和仔豬體重的協(xié)同效應(yīng)。對(duì)每天的上述變量進(jìn)行獨(dú)立方差分析。不同處理組間分娩后24 h（窩標(biāo)準(zhǔn)化以后）直至斷奶期間的仔豬死亡率以非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比分析。本文文中和表格內(nèi)數(shù)據(jù)除特別注明外，均以最小二乘均數(shù)±最大標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P≤0.1作為趨勢(shì)判斷標(biāo)準(zhǔn)，P≤0.5作為顯著性差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

母豬泌乳期間各周的每日平均采食量及仔豬的體重和體增重如表2所示。Repeated-in-time分析表明母豬采食量受哺乳時(shí)間的影響（P<0.001）而不同的處理組間無(wú)顯著差異（P>0.10）。每周分析結(jié)果表明，在哺乳期的第一周，21D組母豬的采食量有高于2D和7D組母豬的趨勢(shì) （P<0.10）；不同處理的仔豬體重及增重在56日齡前無(wú)明顯差異（P>0.10）。2D、7D和21D組仔豬出生后24 h至斷奶期間的死亡率分別為6.70%、11.22%和9.52%；與2D組相比，7D組的仔豬死亡率具有升高的趨勢(shì)（P<0.10）；2D、7D和21D組窩仔豬死亡頭數(shù)分別為0.80、1.33和1.10頭。

表3所示為泌乳期第21天血液中催乳素、IGF-1、尿素和葡萄糖的濃度，不同處理間無(wú)明顯差異（表3）。此外，在泌乳期第21天，不同處理間的乳成分（干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖）含量也無(wú)明顯不同（P>0.10）（表4）。

Repeated-in-time分析顯示，在妊娠期第110天和泌乳第21天，不同處理組的母豬乳腺薄壁組織中PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B、LALBA和IGFBP-5基因的mRNA相對(duì)豐度存在顯著的采樣日效應(yīng)（P<0.01）（表5）。與泌乳期第21天相比，妊娠期第110天時(shí)的PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B和IGFBP-5表達(dá)水平更高，而LALBA則更低。在妊娠期第110天，不同處理對(duì)PRL表達(dá)水平的影響顯著不同（P=0.05），21D組母豬顯著高于7D組母豬。在泌乳期第21天，該效應(yīng)不再存在，但7D組母豬的STA5B基因表達(dá)水平高于2D組母豬（P=0.05），而IGFBP-5表達(dá)水平有低于2D組母豬的趨勢(shì)（P<0.10）。2D組母豬的LALBA mRNA豐度也出現(xiàn)了低于7D組母豬的趨勢(shì)（P<0.10）。

3 討論

早期研究結(jié)果表明，第一胎的哺乳期中沒(méi)有被啟用的乳頭會(huì)對(duì)第二胎時(shí)吮吸該乳頭的仔豬的生長(zhǎng)產(chǎn)生不良的影響（Farm等，2012）。這就引發(fā)了在第一胎的泌乳期中乳頭必須被吮吸多少時(shí)間才不會(huì)影響第二胎的泌乳期吮吸該乳頭仔豬生長(zhǎng)速度的疑問(wèn)。本文的研究結(jié)果首次證明了第一胎中哺乳時(shí)間從2 d延長(zhǎng)到7 d或21 d并不會(huì)提高下一個(gè)哺乳期中仔豬的生長(zhǎng)速度。這表明在第一胎的哺乳期中乳頭持續(xù)吮吸 2 d足以使乳腺得到充分的發(fā)育和基因表達(dá)，從而在第二胎的哺乳期中不會(huì)對(duì)泌乳量產(chǎn)生不良的影響。

本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒煌贔armer等（2012）所用的模型：在本研究中，處理組是針對(duì)第一個(gè)哺乳期的所有乳腺組織，而之前研究是針對(duì)特定的乳頭。雖然仔豬吮吸按摩程度與會(huì)影響母豬泌乳量的激素狀態(tài)（如催產(chǎn)素的釋放）之間有著一定的相關(guān)性，但仔豬的斷奶體重主要還是取決于單個(gè)乳腺組織泌乳量的差異（Fraser等，1979）。實(shí)際上，每一個(gè)乳腺組織的乳合成組織獨(dú)立于其相鄰的乳腺組織，單頭仔豬的增重與其所吮吸的乳腺重量存在相關(guān)性。此外，泌乳期間乳腺發(fā)育似乎在乳腺水平上調(diào)節(jié)著。

仔豬吮吸刺激對(duì)乳腺發(fā)育和泌乳量的重要性最近才被提出。Theil等（2005）指出，泌乳早期連續(xù)3 d未被吮吸的乳腺會(huì)發(fā)生不可逆的萎縮，而1 d未被吮吸的乳腺則可以恢復(fù)但整個(gè)哺乳期的泌乳量會(huì)低于經(jīng)常性吮吸的乳腺（吮吸這些乳腺的仔豬體重會(huì)下降23%）。與經(jīng)常性被仔豬吮吸的乳腺組織相比，1 d或3 d未被仔豬吮吸的乳腺其基因的表達(dá)會(huì)改變，PRLR mRNA和LALBA mRNA被下調(diào)，而IGFBP-5 mRNA則會(huì)被上調(diào)。這些改變?cè)诒蛔胸i停止吮吸1 d但不是3 d的乳腺組織中是可逆的。因此，乳頭停止使用的時(shí)間對(duì)乳腺組織中乳腺基因的表達(dá)具有重要的影響。Farmer等（2012）的研究結(jié)果表明，乳頭的停止使用可能存在延滯效應(yīng)，從而對(duì)下一個(gè)哺乳期的泌乳產(chǎn)生負(fù)面影響。

研究顯示，分娩后仔豬吮吸的持續(xù)時(shí)間對(duì)于維持母豬每個(gè)乳腺組織的泌乳至關(guān)重要。當(dāng)接受短暫吮吸（如12 h～14 h）的乳腺與未被仔豬吮吸或經(jīng)常性接受吮吸的乳腺相比較時(shí)，接受短暫吮吸和未接受吮吸的乳腺組織均會(huì)發(fā)生萎縮，因此無(wú)法維持正常的泌乳功能。另一方面，在上述兩種情況下，乳腺細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)至少需要6 d，表明12 h～14 h的吮吸時(shí)間足以使乳腺能夠維持與泌乳早期接受經(jīng)常性吮吸的乳腺組織相近的乳腺細(xì)胞增殖速度。這些發(fā)現(xiàn)非常有意義，因?yàn)樗鼈冏C明了產(chǎn)后早期仔豬吮吸的一個(gè)長(zhǎng)期效應(yīng)。同時(shí)，乳腺組織的基因表達(dá)同樣存在著重大變化：與分娩后接受經(jīng)常性吮吸的乳腺相比，未接受吮吸和短暫接受吮吸的乳腺組織中PRLR mRNA豐度降低而IGFBP-5 mRNA豐度則升高。因此，研究人員得出結(jié)論，高水平的催乳素受體轉(zhuǎn)錄和低水平的IGFBP-5轉(zhuǎn)錄對(duì)于乳腺維持泌乳功能非常重要。這與Tonner等（2000）的研究結(jié)果一致，后者報(bào)道IGFBP-5參與了引發(fā)乳腺萎縮的生理過(guò)程。本文的研究結(jié)果顯示，在第二胎的泌乳期，21D組母豬在妊娠期第110天PRL mRNA豐度增加，而2D組母豬在泌乳期第21天乳腺中IGFBP-5的基因表達(dá)水平升高。因此，仔豬吮吸的持續(xù)性對(duì)下一個(gè)胎次母豬乳腺薄壁組織的基因表達(dá)具有延滯效應(yīng)。2D組母豬在第二胎泌乳期第21天時(shí)LALBA基因的mRNA表達(dá)的下降趨勢(shì)也證實(shí)了該假設(shè)，但已觀測(cè)到對(duì)乳腺基因表達(dá)的作用還不足以引起仔豬增重的改變。

本研究關(guān)于乳腺薄壁組織中LALBA mRNA表達(dá)與Theil等和VanKlompenberg等（2013）的研究結(jié)果一致，他們報(bào)道由于乳合成能力的提高妊娠后期至泌乳早期LALBA基因表達(dá)水平大幅提高。就我們所知，本研究是首次報(bào)道妊娠后期PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B和IGFBP-5等基因mRNA豐度提高。Theil（2006）報(bào)道，PRLR基因表達(dá)在妊娠后期和泌乳早期之間沒(méi)有變化，而IGFBP-5的基因表達(dá)只有略微的提高。產(chǎn)生這種不一致結(jié)果的原因還不清楚，但考慮到催乳素參與了乳腺發(fā)育，且在妊娠后期啟動(dòng)泌乳，當(dāng)前的研究結(jié)果并不出人意料。

本文研究結(jié)果顯示不同處理方式對(duì)乳成分組成沒(méi)有影響，這與之前的研究結(jié)果一致，即第二胎的功能性乳頭（在第一胎中不論是否被吮吸過(guò)）所分泌的乳汁在組成上均無(wú)差異（Farmer等，2012），考慮到本研究中所有乳頭在第一胎時(shí)都至少被吮吸2 d，因此乳成分不會(huì)產(chǎn)生差異。唯一一個(gè)調(diào)查在第一胎時(shí)未被吮吸的乳頭對(duì)其在第二胎中泌乳能力影響的研究沒(méi)有測(cè)定乳的成分（Fraser等，1992）。催乳素對(duì)維持母豬泌乳的重要作用已經(jīng)得到證明，在本研究中，泌乳后期血液中催乳素、IGF-1、尿素和葡萄糖的濃度沒(méi)有變化，與母豬有相近的泌乳量、乳成分組成和采食量相符合。

綜上所述，Theil等（2006）證實(shí)，分娩后前12 h～14 h的吮吸不足以啟動(dòng)和維持母豬的泌乳，因此，規(guī)律性吮吸才能維持母豬的持續(xù)泌乳。但分娩后啟動(dòng)泌乳所需要的最短吮吸時(shí)間沒(méi)有測(cè)定。本研究結(jié)果表明，分娩后持續(xù)48 h的規(guī)律性吮吸足以啟動(dòng)母豬的泌乳過(guò)程，這樣下一個(gè)胎次的泌乳不會(huì)受到負(fù)面影響（Farmer等，2012），本文的研究結(jié)果對(duì)頭胎母豬的生產(chǎn)管理極為重要。