王美軍，黃科，龔雨順，馬先鋒

[摘 要] 激光共聚焦掃描顯微鏡是一種領(lǐng)先的實(shí)驗(yàn)手段，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，因此掌握其操作使用方法和進(jìn)行基本的維護(hù)十分重要。介紹了激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)硬件和軟件部分的構(gòu)成；熒光樣品的制備及要求；樣品進(jìn)行普通拍攝時(shí)光路、熒光檢測(cè)通道及圖像采集等參數(shù)的設(shè)置；最后在儀器的維護(hù)與管理上提出應(yīng)保持室內(nèi)整潔且溫濕度適宜，同時(shí)在操作使用上應(yīng)按嚴(yán)格的操作規(guī)范進(jìn)行。

[關(guān) 鍵 詞] Zeiss LSM710；激光共聚焦顯微鏡；操作使用；管理

[中圖分類號(hào)] TH742 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [文章編號(hào)] 2096-0603（2018）07-0234-02

激光共聚焦掃描顯微鏡是一種現(xiàn)代化的光學(xué)顯微鏡，它在生物、醫(yī)學(xué)及工業(yè)等領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。與普通光學(xué)顯微鏡不同的是，它以極細(xì)的激光束（點(diǎn)光源）替代傳統(tǒng)的汞燈或長(zhǎng)效金屬鹵素?zé)簦▓?chǎng)光源）作為激發(fā)光，具有良好的匯聚性，且激光束激發(fā)的樣品區(qū)域大大縮小，減少了同一視野內(nèi)相鄰樣品之間的發(fā)射信號(hào)干擾，其分辨力提高了30%～40%。此外，激光共聚焦掃描顯微鏡在檢測(cè)器前，焦平面的共軛位置加裝Pinhole。由于只有來自焦平面的發(fā)射光信號(hào)可以在共軛位置匯聚，穿過Pinhole，而來自非焦平面的發(fā)射光信號(hào)在共軛位置是發(fā)散的，絕大部分被Pinhole阻擋，所以檢測(cè)器只能接收來自焦平面的發(fā)射光信號(hào)。這樣，激光共聚焦掃描顯微鏡在很大程度上限制了來自非焦平面的信號(hào)干擾，大大增強(qiáng)了圖像的信噪比。

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院配置的是Zeiss LSM710倒置激光共聚焦顯鏡。文章以倒置共聚焦顯微為例，介紹了其硬軟件的構(gòu)成，熒光樣品的制備要求、樣品拍攝的參數(shù)設(shè)置及儀器的維護(hù)與管理。

一、激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的組成

激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)由硬件和軟件部分組成，其中硬件部分為電動(dòng)熒光顯微鏡、掃描檢測(cè)單元、激光器、電腦工作站，軟件部分為ZEN操作分析軟件。

（一）顯微鏡硬件部分

1.激光器。激光器覆蓋范圍較廣，能夠滿足多種熒光樣品成像需求，一般有四種，即近紫外Diode固體激光器405nm、藍(lán)激光Argon多線激光器458/488/514nm、綠激光He-Ne激光器543nm、紅激光He-Ne激光器633nm。

2.電動(dòng)熒光顯微鏡。電動(dòng)熒光顯微鏡分為正置顯微鏡和倒置顯微鏡，物鏡有低倍和高倍，低倍物鏡為5倍、10倍和20倍；高倍物鏡為40倍、63倍油鏡和100倍油鏡。

3.熒光掃描檢測(cè)器。檢測(cè)器檢測(cè)范圍為400～800nm，DIC通道1個(gè)，而光譜型熒光檢測(cè)器能在可見光范圍一次性全光譜掃描，其通道有34個(gè)。

4.電腦工作站。電腦工作站有Real Time PC 和User PC，Real Time PC是硬件與軟件間的連接器。

（二）顯微鏡軟件部分

激光共聚焦掃描顯微鏡軟件有ZEN2011軟件，ZEN軟件分為Zen2011 Black和Zen2011 Blue。電腦開機(jī)進(jìn)入操作系統(tǒng)界面后，雙擊桌面共聚焦軟件ZEN圖標(biāo)，進(jìn)入ZEN界面，彈出對(duì)話框可選擇“Start System”和“Image Processing”。“Start System”為初始化整個(gè)系統(tǒng)，用于激光掃描取圖、分析等。“Image Processing”為不啟動(dòng)共聚焦掃描硬件，用于已存圖像數(shù)據(jù)的處理、分析。

軟件的工具欄有不同的主頁面，分別為L(zhǎng)ocate、Acquisition、FCS、Processing和Maintain。Locate主頁面用于目鏡下觀察樣品，可以控制顯微鏡部分的電動(dòng)元件，方便用戶完成樣品觀察。Acquisition主頁面用于圖像掃描，包含了掃描圖像所需的各種參數(shù)設(shè)置。FCS主頁面只在LSM 780和Confocor中出現(xiàn)，用于熒光相關(guān)光譜的檢測(cè)和分析。Processing主頁面包含了軟件提供的圖像處理工具。

Maintain主頁面提供了調(diào)節(jié)Pinhole位置，設(shè)置物鏡的工具，可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的系統(tǒng)維護(hù)。

二、熒光樣品的制備

激光共聚焦顯微鏡需要對(duì)沒有自發(fā)熒光的生物樣品進(jìn)行前處理，使其具有熒光標(biāo)記，再進(jìn)行檢測(cè)。獲得一份好的熒光標(biāo)記的樣品是拍攝到一張好照片的先決條件，沒有好的樣品，即使有再高端的設(shè)備，再有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員，也難以順利地觀察到樣品的熒光圖像。

（一）染料的選擇

傳統(tǒng)用于熒光標(biāo)記的染料GFP、EGFP、YFP、DAPI、FM4-64、ECFP、ALexa-488、ALexa-546、ALexa-633等。DAPI和Alexa-405等染料可用405nm激光器觀察；GFP、EGFP、YFP、Alexa-488等熒光蛋白可用氬離子激光器觀察；RFP、Alexa-546和Cy3等染料可用543nm激光器觀察；Alexa-647和Cy5等染料可用633nm激光器觀察。

（二）熒光表達(dá)載體的構(gòu)建與導(dǎo)入

通過分子生物學(xué)技術(shù)可進(jìn)行熒光蛋白的構(gòu)建，即通過PCR擴(kuò)增目的蛋白的cDNA，接入熒光蛋白表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)。構(gòu)建好的熒光表達(dá)載體進(jìn)行大量擴(kuò)增、純化、轉(zhuǎn)染并導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。

（三）熒光樣品制備

熒光樣品制備是生物學(xué)研究的基本技術(shù)和方法，其制備需要一定的過程，制備的順序分為觀察、固定、脫水包埋、切片粘片、通透、封閉、一抗、二抗、復(fù)染和封片。固定在樣品制備中很重要，固定液的選擇應(yīng)能最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，能最大限度地保存抗原的免疫活性，常用的固定液是4%的中性甲醛。對(duì)組織樣品來說，需脫水包埋，即用石蠟包埋，梯度脫水，如是冷凍切片可直接用OTC包埋。組織樣品的切片厚度應(yīng)根據(jù)自己的材料特性決定，粘片時(shí)須平整。通透時(shí)可用乙醇和丙酮等試劑提高免疫染色效率，增強(qiáng)通透性。封閉可有效降低背景熒光信息，更好地觀察所需信號(hào)。一抗是整個(gè)免疫染色流程的核心，可通過做陽性對(duì)照，檢測(cè)一抗的特異性及摸索出合適的稀釋濃度。復(fù)染能夠確定細(xì)胞的位置和結(jié)構(gòu)。最后的封片建議購買商品化的封片劑，蓋玻片的厚度和折光率需達(dá)標(biāo)。

三、普通拍攝相關(guān)參數(shù)設(shè)置

（一）光路（channel）設(shè)置

對(duì)樣品的染料組合進(jìn)行配置是激光共聚焦掃描顯微鏡成像的第一步。通過打開軟件選擇Start system，在目鏡下找到合適的視野和焦平面后，在Acquisition的smart setup中分別選擇染料類型和偽色完成染料的配置。掃描的方法有三種，即最快速掃描（Fastest）、最佳信號(hào)掃描（Best signal）和兼顧速度與信號(hào)的折中式掃描（Smartest）。如果激光波長(zhǎng)不同，可以選擇Smartest（Line）模式，可將不同的染料放在不同通道里，減少或避免串色，同時(shí)可收集兩個(gè)通道的信號(hào)。

（二）熒光檢測(cè)通道的調(diào)節(jié)

光路設(shè)置的參數(shù)很多，每一個(gè)參數(shù)都關(guān)系到圖片成像的質(zhì)量，因此需要對(duì)熒光檢測(cè)通道進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。

1.針孔（Pinhole）。針孔阻斷聚焦平面以外的信號(hào)進(jìn)入，針孔直徑大小的設(shè)置很關(guān)鍵。針孔直徑越大，被收集到的熒光信號(hào)就越多，但收集到樣品的非焦面的雜射光也越多，同時(shí)樣品的成像厚度也隨之增厚，得到的信噪比反而不好。因此，在保證圖像質(zhì)量的前提下，針孔一般設(shè)置為1AU，在最大程度上屏蔽非焦平面的信號(hào)。

2.激光強(qiáng)度。激光強(qiáng)度需設(shè)置在合理的范圍值，例如，激光488nm、514nm等，參考值在10～20范圍內(nèi)。

3.激光管電壓（Gain Master）。激光管電壓用于調(diào)節(jié)圖像的亮度和對(duì)比度，數(shù)值越大，檢測(cè)PMT上所負(fù)荷的電壓越高，圖像信號(hào)越明亮。同時(shí)，隨著激光管電壓的增高，標(biāo)本容易被漂白或淬滅。而且隨著激光管使用壽命的增加，激光的亮度會(huì)有所下降。因此，在保證圖像質(zhì)量的前提下，電壓值越低越好，一般設(shè)置在600～800范圍內(nèi)，最高不要超過850。

4.光電倍增管增益（Digital Gain）。對(duì)所有信號(hào)進(jìn)行數(shù)碼放大，包括來自樣品的真實(shí)信號(hào)和環(huán)境背景噪音。電壓增大，信號(hào)和噪音會(huì)增強(qiáng)，電壓減小則信號(hào)和噪音均減小。原則上，在保證圖像質(zhì)量的前提下，Gain值越小越好，一般設(shè)置為數(shù)值1.0～1.2。

5.數(shù)碼降噪和數(shù)碼增益（Digital Offset）。用以調(diào)節(jié)圖像背景，數(shù)值越小，背景越暗。原則上，Digital Offset值越接近0越好。

（三）圖像采集參數(shù)設(shè)置

在圖像獲?。ˋcquisition Mode）的參數(shù)設(shè)置中，圖像的分辨率（Frame Size）可設(shè)置為512×512或1024×1024；在掃描速度（speed）中，如是單張掃描可將速度設(shè)置為數(shù)字6或7；層掃或大圖拼接可設(shè)置為8；Averaging Number可設(shè)置為數(shù)字2或4。

在圖像預(yù)覽時(shí)，可使用Range Indicator檢查圖像是否過曝，如果出現(xiàn)紅色點(diǎn)表示過曝，一般一張圖片不允許紅色點(diǎn)的出現(xiàn)超過1%；出現(xiàn)藍(lán)色點(diǎn)表示曝光不足；白色點(diǎn)則表示正常。

四、激光共聚焦掃描顯微鏡的維護(hù)與管理

（一）保持室內(nèi)整潔

激光共聚焦顯微鏡是極為精細(xì)的儀器，為保證良好的成像質(zhì)量，對(duì)室內(nèi)潔凈度要求較高。為保持室內(nèi)的整潔，應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凈化和除塵，保持室內(nèi)空氣潔凈；進(jìn)入顯微鏡房的人員應(yīng)穿著整潔的實(shí)驗(yàn)服，更換專用的鞋套或拖鞋。同時(shí)應(yīng)定期打掃實(shí)驗(yàn)室，保證工作環(huán)境的潔凈。每次操作使用完后，應(yīng)使用防塵罩遮蓋顯微鏡和掃描頭。

（二）室內(nèi)溫濕度適宜

顯微鏡房溫濕度需控制在合適的范圍，通過安裝冷暖空調(diào)，保證室內(nèi)溫度常年維持在22℃左右，如果需要做時(shí)間序列的實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)期間溫度的變化不能超過0.5度/小時(shí)。濕度一般控制在40%～60%，當(dāng)室內(nèi)溫度在攝氏30℃時(shí)，相對(duì)濕度應(yīng)低于65%。在南方地區(qū)，天氣比較潮濕，為了保護(hù)光學(xué)鏡頭避免霉變，建議用戶配置除濕機(jī)。北方用戶視要求需要加裝加濕器。

（三）操作使用規(guī)范

日常操作嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，遵守儀器的開關(guān)機(jī)流程。激光共聚焦掃描顯微鏡硬件的開機(jī)順序依次為打開穩(wěn)壓電源、主開關(guān)（Main Switch）、熒光顯微鏡和電腦電源（Systems/PC）、掃描頭和激光柜電源（Components）、熒光燈、激光器和電腦電源。在確保激光器充分散熱后關(guān)機(jī)應(yīng)按著顛倒開機(jī)的順序依次關(guān)閉電腦、激光器等。

實(shí)驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好刻錄光盤，使用刻錄光驅(qū)刻錄圖像數(shù)據(jù)資料，嚴(yán)禁使用U盤拷貝資料。每次操作使用后需對(duì)物鏡、目鏡、聚光鏡以及載物臺(tái)面進(jìn)行徹底清潔。

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