趙燕燕 習(xí) 崗

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高粱種子萌發(fā)過程中超微弱光子輻射的特征

趙燕燕1,*習(xí) 崗2

1鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院, 河南鄭州 451100;2西安理工大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用物理系, 陜西西安 710048

采用50 μg mL–1的蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D (actinomycin D, AMD)、100 μg mL–1的蛋白質(zhì)合成翻譯抑制劑環(huán)己亞胺(cycloheximide, CHM)和650 μg mL–1的呼吸抑制劑NaN3處理萌發(fā)高粱種子, 研究了高粱種子萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射和LED誘導(dǎo)的延遲光子輻射的動(dòng)力學(xué)特征及其變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 高粱萌發(fā)過程中的自發(fā)光子輻射強(qiáng)度與種子鮮質(zhì)量的變化呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.93121), AMD和CHM不同程度地抑制了萌發(fā)過程中高粱鮮質(zhì)量的增長, NaN3幾乎完全抑制了鮮質(zhì)量的增長, 表明高粱萌發(fā)過程中的自發(fā)光子輻射強(qiáng)度可以作為萌發(fā)狀況的信號, RNA/DNA合成反應(yīng)是高粱萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射的來源之一, 呼吸代謝是其主要來源。高粱萌發(fā)過程中的延遲光子輻射特征可用動(dòng)力學(xué)參數(shù)初始光子數(shù)、相干時(shí)間和延遲光子輻射積分強(qiáng)度定量表達(dá), 通過對延遲光子輻射積分強(qiáng)度的測量和分析可以實(shí)時(shí)、靈敏和無損傷的了解和判斷高粱萌發(fā)過程中細(xì)胞代謝系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化。

高粱; 萌發(fā); 超微弱光子輻射; 蛋白質(zhì)合成抑制劑; 呼吸代謝抑制劑; 無損檢測

高粱用途廣泛, 經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 并且耐鹽堿和對土壤適應(yīng)能力強(qiáng), 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1-2]。近年來, 能源危機(jī)和環(huán)境污染日益嚴(yán)重, 高粱作為重要的能源作物, 越來越引起重視[3-4], 高粱萌發(fā)期的抗逆機(jī)理及其評價(jià)成為關(guān)注的熱點(diǎn), 有關(guān)研究集中在形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)方面[2,5-9]。由于形態(tài)指標(biāo)的獲取費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 不能做到早期診斷; 生理生化指標(biāo)大多來源于破壞性的試管實(shí)驗(yàn), 不適應(yīng)于珍稀物種, 判斷結(jié)果也不準(zhǔn)確, 亟待研究能夠反映細(xì)胞代謝及其功能狀態(tài)變化, 并能夠做到無損檢測的新技術(shù), 種子萌發(fā)過程中超弱光子輻射的研究有可能滿足這一要求。

生物超微弱光子輻射是普遍存在于所有生命系統(tǒng)中的一種連續(xù)發(fā)光現(xiàn)象, 其輻射強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光[10]。種子萌發(fā)過程中的超微弱光子輻射, 包括萌發(fā)種子在暗中的自發(fā)光子輻射和在外界光誘導(dǎo)下的延遲光子輻射。生物光子學(xué)的研究表明, 來自于活細(xì)胞的超微弱光子輻射包含著豐富的生命信息, 自發(fā)光子輻射與生物體內(nèi)的細(xì)胞分裂、細(xì)胞死亡、光合作用、生物氧化、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信息傳遞與功能調(diào)節(jié)等重要的生命過程密切相關(guān)[11-14], 延遲光子輻射與生物系統(tǒng)的功能狀態(tài)有關(guān), 是細(xì)胞生理狀態(tài)的靈敏指標(biāo), 已被應(yīng)用于評價(jià)植物系統(tǒng)的功能狀態(tài)和對環(huán)境脅迫的檢測[15-16]。因此, 超微弱光子輻射的研究有可能為活體細(xì)胞代謝與功能狀態(tài)提供一種非侵入性的光學(xué)活檢新技術(shù)[17]。目前, 盡管已有紅豆[18]、大麥[19]、豇豆[20]、小麥[21]、大豆[22]、玉米[23]等萌發(fā)種子超微弱光子輻射的研究報(bào)道, 但是, 有關(guān)輻射機(jī)理和信息挖掘的研究不夠, 且未見萌發(fā)高粱超弱光子輻射的研究報(bào)道。

本文研究了高粱種子萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射和延遲光子輻射的變化規(guī)律, 并通過施加蛋白質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D (AMD)、翻譯抑制劑環(huán)己亞胺(CHM)和呼吸抑制劑NaN3, 探討了輻射的來源與意義, 研究結(jié)果對于揭示高粱種子萌發(fā)過程中超弱光子輻射的機(jī)理、評價(jià)高粱抗逆性、鑒定與開發(fā)種質(zhì)資源等方面的無損檢測新技術(shù)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

供試材料為萬農(nóng)兩糯1號高粱種子。參照文獻(xiàn)[24]的方法, 通過預(yù)備試驗(yàn)選擇呼吸抑制劑為650 μg mL–1的NaN3溶液, 對于蛋白質(zhì)合成抑制劑, 采用美國Sigma公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D (AMD)和翻譯抑制劑環(huán)己亞胺(CHM)。參照文獻(xiàn)[25]選取AMD溶液濃度為50 μg mL–1, CHM溶液濃度為100 μg mL–1。

挑選形狀、大小相近的飽滿種子2400粒, 經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的HgCl2消毒和清洗后, 平均分成12組, 每組200粒, 放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿, 分別加入等量的蒸餾水(對照組)、650 μg mL–1的NaN3溶液、50 μg mL–1的AMD溶液和100 μg mL–1的CHM溶液, 置PRX-1000A型人工培養(yǎng)箱(杭州得聚儀器設(shè)備有限公司), 在溫度、相對濕度、PPFD分別為35℃、50%、50 μmol m–2s–1的條件下培養(yǎng)。對照組和各處理組均設(shè)置3個(gè)重復(fù), 從開始培養(yǎng)起, 每天定時(shí)測量各組各重復(fù)中隨機(jī)選取的20粒高粱種子的數(shù)據(jù)。

1.2 種子鮮質(zhì)量的測量

從種子培養(yǎng)當(dāng)天開始(設(shè)為0點(diǎn)), 使用JA103H型電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司, 精度1 mg)每天定時(shí)隨機(jī)測量各組中20粒萌發(fā)高粱種子的鮮質(zhì)量。測量時(shí)用濾紙吸干種子表面水分, 設(shè)3組重復(fù), 取平均值。

1.3 自發(fā)光子輻射的測量

自發(fā)光子輻射的測量儀器和測量方法見文獻(xiàn)[21]。根據(jù)測量系統(tǒng)樣品杯的大小, 每次分別隨機(jī)選取各組中20粒高粱種子, 用濾紙吸干種子表面液體, 放入樣品室暗處理5 min后測量自發(fā)光子輻射。單位時(shí)間的光子數(shù)為自發(fā)光子輻射的強(qiáng)度, 用SL表示, 單位為counts s–1。對照組、NaN3、AMD和CHM處理組均分別設(shè)置3個(gè)重復(fù), 取3個(gè)重復(fù)測量的平均值。

1.4 延遲光子輻射的測量

采用自制的測量系統(tǒng), 儀器組成和測量方法見文獻(xiàn)[21]。從種子培養(yǎng)開始, 每天定時(shí)取種子20粒, 用濾紙吸干表面溶液, 用藍(lán)色LED激發(fā)后測量延遲光子輻射。光照時(shí)間為30 s, 測量時(shí)間為60 s。每組測量均設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)測量3次, 取平均值。

1.5 延遲光子輻射的動(dòng)力學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[23]的方法, 將延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)曲線按照下式擬合。

式中,為測量時(shí)間(s),0為初始光子數(shù)(counts s–1),為相干時(shí)間(s),為衰減常量, 是一個(gè)無量綱的常數(shù),SL為單位時(shí)間的自發(fā)光子輻射(counts s–1)。

延遲光子輻射積分強(qiáng)度()可由式(1)的積分得到。

式中,為測量周期(s), 在本文中=60 s。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

對以上測量值應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析,<0.05為顯著水平,<0.01為極顯著水平。運(yùn)用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱萌發(fā)過程中鮮質(zhì)量的變化

從圖1可見, 在吸脹后前 3 d, 對照組高粱種子鮮質(zhì)量隨著萌發(fā)時(shí)間快速增長, 在 3 d后增幅變緩。NaN3、AMD和CHM處理對種子鮮質(zhì)量的增長有抑制作用, 其中, NaN3的抑制作用最大。在第7和第8天時(shí), 對照組高粱種子鮮質(zhì)量相對于萌發(fā)開始時(shí)(第0天)的相對增長率分別為130.11%和138.85%, AMD處理組為69.46%和75.37%, CHM處理組則為42.55%和45.15%, 和對照組相比較差異均達(dá)到了極顯著水平(<0.01), 表明AMD和CHM處理不同程度地抑制了高粱種子的萌發(fā); 在第3天后, NaN3溶液處理的高粱種子鮮質(zhì)量開始下降, 直至低于萌發(fā)開始時(shí)的質(zhì)量, 表明NaN3溶液完全抑制了高粱種子的萌發(fā)。

圖1 高粱萌發(fā)過程中鮮質(zhì)量的變化

2.2 高粱萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射的變化

從圖2可以看出, 在吸脹后前3 d, 對照組高粱種子自發(fā)光子輻射隨著萌發(fā)時(shí)間快速增長, 在3 d后不再增加, 呈現(xiàn)出小幅震蕩的趨勢。AMD和 CHM處理使高粱種子自發(fā)光子輻射強(qiáng)度明顯下降, 其中, CHM處理對自發(fā)光子輻射的影響要大于CHM處理。在萌發(fā)第8天時(shí), 對照組高粱種子的自發(fā)光子輻射強(qiáng)度相對于第0天的相對增長率為36.26%, AMD處理組為20.28%, CHM處理組為13.45%; 經(jīng)過NaN3處理的高粱種子在第3天自發(fā)光子輻射強(qiáng)度開始呈逐漸下降的趨勢, 并在萌發(fā)后期穩(wěn)定在較低(低于初始)水平, 表明NaN3完全抑制了高粱種子萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射的增長。

圖2 高粱萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射的變化

2.3 高粱萌發(fā)過程中延遲光子輻射的變化

2.3.1 延遲光子輻射曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

為了定量分析高粱種子萌發(fā)時(shí)延遲光子輻射的特征及差異, 將各處理?xiàng)l件下的延遲光子輻射數(shù)據(jù)按照式(1)擬合, 得到高粱種子萌發(fā)時(shí)的延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1~表4。由表1~表4可見, 各參數(shù)的擬合優(yōu)度都在0.99以上, 說明表1~表4中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)很好的描述了式(1)所表述的延遲光子輻射的動(dòng)力學(xué)行為。

2.3.2 延遲光子輻射積分強(qiáng)度的變化 延遲光子輻射曲線下的面積稱延遲光子輻射積分強(qiáng)度, 用()表示, 其數(shù)值可由式(2)求出。將表1~表4中的各動(dòng)力學(xué)參數(shù)帶入式(2), 可以得到各延遲光子輻射的積分強(qiáng)度()。由圖3可見, 在高粱萌發(fā)過程中各組的延遲光子輻射積分強(qiáng)度()在前 3 d也呈現(xiàn)出不同程度增長的趨勢。在第3天后, 對照組出現(xiàn)小幅震蕩, 在第8天時(shí)相對于第0天的相對增長率為32.99%; AMD和CHM處理組和對照組類似, 在第8天時(shí)相對于第0天的相對增長率分別為20.38%和8.89%; 而經(jīng)過NaN3處理的高粱種子則從第3天快速下降至較低水平。

3 討論

種子在萌發(fā)過程中吸水膨脹, 啟動(dòng)DNA和RNA合成反應(yīng), 細(xì)胞開始分化, 各種水解酶和生物分子大量合成, 在宏觀上表現(xiàn)為種子鮮質(zhì)量的增加, 因此, 萌發(fā)種子的鮮質(zhì)量可以作為表征種子萌發(fā)狀況的宏觀指標(biāo)。

表1 對照組萌發(fā)高粱延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表2 NaN3處理組萌發(fā)高粱延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表3 AMD處理組萌發(fā)高粱延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4 CHM處理組萌發(fā)高粱延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖3 高粱萌發(fā)過程中延遲光子輻射積分強(qiáng)度的變化

為了探討高粱萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射的來源,本文進(jìn)一步研究了蛋白質(zhì)合成抑制劑AMD和CHM對萌發(fā)高粱自發(fā)光子輻射的影響。發(fā)現(xiàn)AMD和CHM對萌發(fā)高粱的自發(fā)光子輻射和鮮質(zhì)量的增長都有同步的抑制作用, 但CHM的抑制程度比AMD大。由于AMD是蛋白質(zhì)合成中轉(zhuǎn)錄過程的抑制劑, 50 μg mL–1的AMD足以完全抑制RNA的合成[26], 圖1中AMD處理組萌發(fā)高粱種子鮮質(zhì)量緩慢增加說明了萌發(fā)高粱種子中存在著長命mRNA, 由其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)合成的翻譯過程不受AMD影響, 而圖2揭示的AMD對自發(fā)光子輻射存在抑制作用說明高粱萌發(fā)過程中有一部分自發(fā)光子輻射來源于RNA合成反應(yīng)。由于對DNA的抑制也會(huì)造成對RNA的抑制, 因此, 高粱萌發(fā)過程中的RNA/DNA合成反應(yīng)可能是自發(fā)光子輻射的來源。

CHM是蛋白質(zhì)合成中翻譯過程的抑制劑, 作用于80S核糖體, 通過抑制蛋白質(zhì)合成中的移位酶反應(yīng), 迅速而完全地阻斷細(xì)胞中絕大部分蛋白質(zhì)合成反應(yīng)[26]?；诜N子吸脹3 d以后的鮮質(zhì)量源于新蛋白的大量合成[27], 圖1顯示的100 μg mL–1的CHM作用下種子鮮質(zhì)量在吸脹3 d以后不再增長, 表明本研究采用CHM濃度完全抑制了高粱萌發(fā)過程中的蛋白質(zhì)合成。由于在呼吸代謝中, 呼吸電子傳遞鏈中的電子漏會(huì)直接還原氧生成各種活性氧自由基, 這些自由基經(jīng)過重組、裂解和歧化等一系列反應(yīng)生成處于三重激發(fā)態(tài)的過氧化物, 或者單線態(tài)氧和激發(fā)態(tài)羰基, 后者經(jīng)過退激后會(huì)產(chǎn)生光子輻射[11,19], 而種子吸脹萌發(fā)第3天后呼吸電子傳遞鏈中的主要復(fù)合蛋白體來自于蛋白質(zhì)的從頭合成[27], 由此推測, CHM通過阻斷萌發(fā)高粱中呼吸電子傳遞鏈的主要組分復(fù)合蛋白體的合成, 形成對呼吸代謝的抑制, 造成了自發(fā)光子輻射的下降(圖2)。CHM對萌發(fā)高粱自發(fā)光子輻射的抑制比AMD大, 說明呼吸代謝可能是高粱萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射的主要來源。由于NaN3是呼吸抑制劑, 其阻斷線粒體呼吸電子傳遞鏈中的電子傳遞, 抑制線粒體吸收O2[28-29], 圖2發(fā)現(xiàn)的NaN3作用下萌發(fā)高粱的自發(fā)光子輻射受到完全抑制證明了上述猜想。至于萌發(fā)3 d以后自發(fā)光子輻射呈現(xiàn)出小幅度震蕩的原因, 可能是高粱種子萌發(fā)過程中, 細(xì)胞吸水膨脹后不斷進(jìn)行有絲分裂, 種子的呼吸代謝強(qiáng)度發(fā)生了周期性變化。

萌發(fā)高粱延遲光子輻射的動(dòng)力學(xué)特征可以通過動(dòng)力學(xué)參數(shù)和延遲發(fā)光積分強(qiáng)度定量表達(dá)。根據(jù)式(1), 初始光子數(shù)0是激發(fā)光停止時(shí)的輻射強(qiáng)度, 在特定光照下, 與處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)有關(guān), RNA/ DNA合成反應(yīng)系統(tǒng)和呼吸代謝系統(tǒng)越完善, 能夠處于高能激發(fā)態(tài)的分子數(shù)越多,0就越大。由表1~表4可知, AMD、CHM和NaN3處理對萌發(fā)高粱種子初始光子數(shù)0的抑制作用依次增強(qiáng), 其中, NaN3完全抑制了0的增長。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是AMD使RNA/DNA合成反應(yīng)中能夠處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)減少, CHM和NaN3分別通過阻礙呼吸電子傳遞鏈中各種復(fù)合蛋白體的合成和對呼吸電子傳遞鏈的影響抑制呼吸代謝中糖酵解/三羧酸循環(huán)(EMP/TCA), 導(dǎo)致呼吸代謝系統(tǒng)中能夠處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)減少和呼吸代謝強(qiáng)度的降低, 后者又必然影響RNA/DNA合成反應(yīng)系統(tǒng)[24], 引起初始光子數(shù)0的進(jìn)一步下降。

相干時(shí)間是延遲光子輻射動(dòng)力學(xué)分析中的另一個(gè)重要參數(shù)。當(dāng)處于激發(fā)態(tài)的分子關(guān)聯(lián)性越好時(shí),就越大。因此,值可以作為組織序性的量度[10]。對比表1和表4可知, AMD使萌發(fā)高粱種子值減小, 表明RNA/DNA合成反應(yīng)系統(tǒng)的序性降低; CHM處理使萌發(fā)高粱種子的值下降, 表明CHM處理造成了呼吸代謝系統(tǒng)的紊亂; NaN3處理造成的萌發(fā)高粱種子值進(jìn)一步減小, 則表明NaN3不但造成了呼吸代謝系統(tǒng)的紊亂, 也造成了RNA/DNA合成系統(tǒng)的破壞。

延遲光子輻射積分強(qiáng)度()是綜合反映延遲光子輻射特征的物理量。細(xì)胞代謝越強(qiáng)烈, 初始光子數(shù)0越多, 相干時(shí)間越大,()就越大, 因此, 延遲光子輻射可以反映細(xì)胞代謝的強(qiáng)度。本文的研究表明, AMD、CHM和NaN3都對萌發(fā)高粱延遲光子輻射積分強(qiáng)度()有抑制作用, 這種抑制是通過對RNA/DNA合成系統(tǒng)和呼吸代謝系統(tǒng)的抑制所引起的, 由此看來, 通過對()的測量和分析有可能對高粱萌發(fā)過程中細(xì)胞代謝系統(tǒng)發(fā)生的動(dòng)態(tài)過程及其發(fā)生的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏和無損傷的了解和判斷, 進(jìn)而在萌發(fā)種子抗逆性評價(jià)等方面發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

萌發(fā)高粱自發(fā)光子輻射強(qiáng)度的增長與種子鮮質(zhì)量的增長正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.93121), 通過對高粱種子萌發(fā)過程中自發(fā)光子輻射強(qiáng)度的測量可以實(shí)現(xiàn)對種子萌發(fā)狀況的無損檢測。高粱萌發(fā)過程中RNA/DNA合成反應(yīng)是自發(fā)光子輻射的來源之一, 呼吸代謝是其主要來源。延遲光子輻射積分強(qiáng)度是綜合反映高粱種子萌發(fā)過程中延遲光子輻射特征的物理量, 由自發(fā)光子輻射、初始光子數(shù)和相干時(shí)間等動(dòng)力學(xué)參數(shù)決定, 通過對高粱萌發(fā)過程中延遲光子輻射的測量和分析有可能對高粱種子萌發(fā)過程中細(xì)胞代謝系統(tǒng)發(fā)生的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏和無損傷的了解和判斷。

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Characteristics of Ultra-weak Photon Emission from Sorghum Seeds during Germination

ZHAO Yan-Yan1,*and XI Gang2

1Zhengzhou University of Industrial Technology, Zhengzhou 451100, Henan, China;2Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Xi’an University of Technology, Xi’an 710048, Shaanxi, China

Ultra-weak photon radiation from germinated seed includes spontaneous photon emission of germinated seeds in the dark and delayed photon radiation induced by external light. In order to study dynamical feature and biological significance of ultra-weak photon radiation from sorghum during germination, 50 μg mL–1protein synthesis transcription inhibitor actinomycin D (AMD), 100 μg mL–1protein synthesis translation inhibitor cycloheximide (CHM) and 650 μg mL–1respiration inhibitor were adopted to treat germinated sorghum seeds separately. There was a positive correlation (correlation coefficient was 0.93121) between the spontaneous photon emission intensity of germinated sorghum and seed fresh mass. AMD and CHM partially inhibited while NaN3almost completely inhibited the increase of fresh mass of sorghum seeds in germination process. It indicated that the spontaneous photon emission intensity from germinated sorghum seed can be taken as a signal of germination status from which RNA/DNA synthesis reaction is one of the sources and respiratory metabolism is the main source. The characteristic of delayed photon emission from germinated sorghum seeds can be expressed quantitatively by dynamical parameters such as initial photon number, coherence time and the integrated intensity of delayed photon emission. The cell metabolism and its changes in germination process of sorghum seeds can be understand and evaluated through a real-time, sensitive and non-destructive analysis of the integrated intensity of delayed photon emission from germinated sorghum seeds.

sorghum; germination; ultra-weak photon radiation; protein synthesis inhibitor; respiratory metabolic inhibitor; non-destructive test

2017-09-08;

2018-01-08;

2018-01-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00783

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471412,51277151)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31471412,51277151).

趙燕燕, E-mail:zhaoyan5416@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180128.2016.012.html