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        基于液質(zhì)聯(lián)用法同時檢測龜甲膠飲片中牛皮源、驢皮源及龜甲膠成分

        2018-05-14 02:11:29郝剛羅丹鐘水生
        中國合理用藥探索 2018年4期
        關(guān)鍵詞:牛皮阿膠飲片

        郝剛,羅丹,鐘水生

        (1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心,江蘇 蘇州 215104;2.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部,浙江 杭州 310014)

        龜甲膠作為常見的膠類藥材,具有滋陰、養(yǎng)血、止血等功效,常用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等癥狀[1]。龜甲來源主要為龜科動物烏龜(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲,然而目前市場上龜甲膠質(zhì)量參差不齊,某些非法生產(chǎn)企業(yè)為追求經(jīng)濟效益,采用牛皮、驢皮等其他動物皮類制成龜甲膠,不僅為人民群眾安全用藥帶來危害,也為傳統(tǒng)藥材的質(zhì)量標準研究提出挑戰(zhàn)[2-6]。本實驗基于超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)建立了同時檢測龜甲膠飲片中牛皮源、驢皮源及龜甲膠等成分的測定方法,實現(xiàn)龜甲膠飲片中主成分鑒別與非法添加成分檢查的同時測定。

        1 材料

        1.1 儀器

        Waters公司超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(儀器型號:ACQUITY Xevo TQ-S);電噴霧離子源(ESI+),Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器;Thermo低溫離心機;MILLIPORE純水儀。

        1.2 樣品與試劑

        龜甲膠對照藥材(批號:121693-201301),黃明膠對照藥材(批號:121695-201301), 阿膠對照藥材(批號:121274-201202)均購自中國食品藥品檢定研究院;序列分析級胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司(批號規(guī)格:T1426-50 mg);實驗用水為超純水,其他試劑均為色譜純。供試品龜甲膠飲片均來源于市場監(jiān)督抽樣。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;毛細管電壓3.0 kV;毛細管溫度:200℃;脫溶劑氣體流量:500 L/h;錐孔氣流量:150 L/h;氬氣為碰撞氣;采用多反應(yīng)檢測模式(MRM)監(jiān)測,以質(zhì)荷比(m/z)631.3(雙電荷)→546.4和(m/z)631.3(雙電荷)→921.4作為龜甲膠特征肽段離子對;(m/z)641.3(雙電荷)→726.2和(m/z)641.3(雙電荷)→783.3作為牛皮源特征肽離子對;(m/z)539.8(雙電荷)→612.4和(m/z)539.8(雙電荷)→924.0作為驢皮源特征肽離子對。

        2.2 色譜條件

        BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動相:以乙腈為流動相A,0.1%甲酸溶液為流動相B,按表1方法進行梯度洗脫;柱溫:20℃;進樣器溫度:15℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:1 μL。梯度洗脫程序見表1。

        表1 梯度洗脫程序

        2.3 溶液制備

        龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材溶液制備:分別取龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材0.1 g,置于50 mL容量瓶中,加1%碳酸氫銨溶液超聲溶解并稀釋至刻度?;旌蠈φ杖芤褐苽洌悍謩e取黃明膠對照藥材溶液、阿膠對照藥材溶液5 mL,置100 mL容量瓶中,加龜甲膠對照藥材溶液稀釋至刻度,過0.22 μm濾膜,取續(xù)濾液100 μL,加胰蛋白酶溶液10 μL(取序列分析級胰蛋白酶,加1%碳酸氫銨溶液制成1 mg/mL的溶液,臨用新配),搖勻,37℃恒溫酶解12 h,進樣分析。

        供試品溶液制備:取龜甲膠飲片打粉,精密稱定粉末0.1 g,置于50 mL容量瓶中,加1%碳酸氫銨溶液超聲溶解并稀釋至刻度,過0.22 μm濾膜,取續(xù)濾液100 μL,加胰蛋白酶溶液10 μL,搖勻,37℃恒溫酶解12 h,進樣分析。

        2.4 方法專屬性

        按上述質(zhì)譜方法和色譜條件檢測龜甲膠、黃明膠、阿膠混合對照溶液,MRM質(zhì)譜如圖1所示,黃明膠對照品藥材保留時間為3.6 min,阿膠對照藥材保留時間為6.03 min,龜甲膠對照藥材保留時間為8.24 min。空白基質(zhì)溶液如圖2所示,結(jié)果表明,空白基質(zhì)溶液在龜甲膠、黃明膠、阿膠保留時間處無干擾。

        圖1 黃明膠、阿膠、龜甲膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

        圖2 空白基質(zhì)溶液色譜圖

        龜甲膠(圖3)、阿膠(圖4)、黃明膠(圖5)對照品藥材溶液分別進樣,實驗結(jié)果表明,在所建方法中,任一對照藥材對其他2種對照藥材的檢測均無干擾,3種對照藥材的特征肽離子對專屬性良好。

        圖3 龜甲膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

        圖4 阿膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

        圖5 黃明膠對照藥材溶液特征離子色譜圖

        2.5 檢測限

        龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材溶液逐級稀釋,以各自特征肽離子對色譜圖信噪比3∶1計算檢測限,結(jié)果表明,龜甲膠檢測限濃度為0.5 mg/L,黃明膠檢測限濃度為2.0 mg/L,阿膠檢測限濃度為1.0 mg/L。

        2.6 重復(fù)性

        取龜甲膠、黃明膠、阿膠對照藥材混合溶液6份,按所建方法進行檢測,分別計算3種對照藥材MRM色譜峰面積,龜甲膠峰面積RSD為3.8%,黃明膠峰面積RSD為4.5%,阿膠峰面積RSD為2.7%,結(jié)果表明所建方法重復(fù)性良好。

        2.7 樣品測定

        收集市場常見品牌的龜甲膠飲片18批,按本實驗所建方法對樣品進行檢測。檢測結(jié)果表明,全部批次樣品檢出龜甲膠特征肽離子對,即符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)鑒別項下相應(yīng)規(guī)定。其中3批樣品檢出牛皮源成分,全部樣品未檢出驢皮源成分(或低于檢測限)。

        3 討論

        UPLC-MS/MS具有分離能力強,分析時間短及高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢,近年來被廣泛應(yīng)用于藥品質(zhì)量標準研究[7-9]?!吨腥A人民共和國藥典》(2015年版)首次將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于膠類藥材的標準檢驗,規(guī)定以質(zhì)荷比(m/z)631.3(雙電荷)→546.4和(m/z)631.3(雙電荷)→921.4作為龜甲膠的特征肽段離子對,從而應(yīng)用于龜甲膠的鑒別[1]。此外,國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2014年7月17日發(fā)布了“龜甲膠中牛皮源與驢皮源成分檢測”的補充檢驗方法(編號:2014013),規(guī)定龜甲膠中不得檢出牛皮源特征肽離子對[(m/z)641.3→726.2和(m/z)641.3→783.3]及驢皮源特征肽離子對[(m/z)539.8→612.4和(m/z)539.8 → 923.8][10]。

        本實驗基于UPLC-MS/MS方法,建立了同時檢測龜甲膠飲片中龜甲膠、牛皮源和驢皮源成分的測定方法,所建方法可專屬性檢測龜甲膠、黃明膠、阿膠的特征肽離子對,且互無干擾,3種對照藥材的方法檢測限均在0.5~2.0 mg/L范圍內(nèi),方法靈敏度高,滿足龜甲膠飲片中牛皮源、驢皮源成分的“摻假”檢查。此外,所建方法將藥典的龜甲膠鑒別方法與補充檢驗方法中驢皮源、牛皮源成分檢查方法相結(jié)合,實現(xiàn)了龜甲膠、牛皮源、驢皮源等成分的同時測定,進一步縮短了分析時間,提高檢測效率,且方法重復(fù)性好,可用于實際樣品測定,為龜甲膠飲片的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

        參考文獻

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        [9]范學(xué)海,朱頤申,陳蘭婷,等.液質(zhì)聯(lián)用在多肽及蛋白質(zhì)定性方面的研究進展[J].生物技術(shù)通報,2014,27(6):62-66.

        [10]國家食品藥品監(jiān)督管理總局,藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件2014013[S].北京,2014.

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