梁寒峭，陳建國(guó)，劉偉，馬保文，榮長(zhǎng)遠(yuǎn)，程池*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京， 100015) 2(聊城正信生態(tài)農(nóng)業(yè)科技園有限公司，山東 聊城， 252000)

釀造醬油(fermented soy sauce)是以大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制成的具有特殊色、香、味的液態(tài)調(diào)味品。最早的醬油由肉類腌制而成，稱為“醢”[hǎi]，后逐步改良發(fā)展，以豆類為主要原料制成的成品風(fēng)味相似且成本較低。無添加釀造醬油中的鮮味物質(zhì)主要來源于原料中的蛋白質(zhì)經(jīng)微生物代謝分泌產(chǎn)生蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶等多酶系作用，生成各種氨基酸，其中以谷氨酸的鮮味最突出。目前，市售的醬油多有添加谷氨酸鈉(味精)的現(xiàn)象，此舉除了增加醬油的鮮味外，還可以大幅度提高氨基酸態(tài)氮的含量，從而顯著提高醬油的等級(jí)。根據(jù)報(bào)道，普通無鹽味精中的氨基酸態(tài)氮含量為7.27 g/100g[1]，500 mL醬油中外添加10 g味精即可提高氨基酸態(tài)氮0.15 g/100g，在氨基酸態(tài)氮的指標(biāo)上將一款一級(jí)醬油輕松地提升為特級(jí)醬油，成本卻只需要2角錢。

隨著人類社會(huì)的進(jìn)步和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的生活水平也越來越高，調(diào)味方式的改變也逐漸成為健康飲食的要素之一，人們從片面追求色、香、味的傳統(tǒng)調(diào)味方式轉(zhuǎn)而向講究原色、原汁、原味的現(xiàn)代健康調(diào)味方式[2-3]。目前在我國(guó)，無添加釀造醬油還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，均執(zhí)行釀造醬油國(guó)標(biāo)，并且市場(chǎng)較為混亂，名稱繁多，有稱零添加醬油(0添加)或純釀醬油等，但其含義均指大豆、小麥等原料經(jīng)微生物發(fā)酵結(jié)束后，不再使用任何食品配料、食品添加劑等進(jìn)行調(diào)配，制備而成的釀造醬油。無添加釀造醬油配料表中只含有大豆或脫脂大豆、小麥和(或)麩皮、食鹽等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味劑(三氯蔗糖、安賽蜜等)、增鮮劑(谷氨酸鈉、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉等)、防腐劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀等)、焦糖色素等。

目前，在國(guó)標(biāo)GB 18186—2000《釀造醬油》中規(guī)定：醬油等級(jí)的理化指標(biāo)主要包含3項(xiàng)，分別為可溶性無鹽固形物、全氮和氨基酸態(tài)氮。第2號(hào)修訂單中又進(jìn)一步要求自2002年1月31號(hào)起醬油產(chǎn)品標(biāo)簽中，要標(biāo)明氨基酸態(tài)氮的含量和質(zhì)量等級(jí)，因此，氨基酸態(tài)氮成為國(guó)標(biāo)規(guī)定的釀造醬油品質(zhì)指征的3大指標(biāo)中唯一被標(biāo)注在產(chǎn)品標(biāo)簽上的數(shù)據(jù)，因此其數(shù)值的高低很大程度上成為消費(fèi)者在醬油選擇中的最主要依據(jù)。但隨著現(xiàn)代食品工業(yè)科技的發(fā)展，谷氨酸鈉、呈味核苷酸等食品添加劑的應(yīng)用增多，氨基酸態(tài)氮的表觀數(shù)值已經(jīng)不能全面反映釀造醬油的真實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本研究分別對(duì)有無食品添加劑的不同種類醬油的氨基酸種類、氨基酸構(gòu)成比例和氨基酸態(tài)氮組成等多方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為釀造醬油的品質(zhì)鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品材料1號(hào)由山東正信生態(tài)農(nóng)業(yè)科技園有限公司提供，樣品材料2號(hào)和3號(hào)購(gòu)自北京超市，具體信息見表1。

表1 樣品材料的基本信息Table 1 Essential information of samples

17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(0.002 50 mol/L，Sigma)；濃鹽酸(濃度≥36%)；冰乙酸，檸檬酸鈉和氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純)；濃硫酸，重蒸酚，茚三酮，還原茚三酮，氫氧化鋰，二甲基亞砜，乙酸鋰，硝酸銀，鉻酸鉀，甲基紅，澳鉀酚綠，硫酸銅，硫酸鉀，硼酸，甲醛，冷凍劑(市售食鹽與冰按1∶3質(zhì)量比混合)；高純氮?dú)?99.99%)。全部試劑除注明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

日立L-8900 高速氨基酸分析儀，日本日立公司；日立鈉離子交接樹脂(4.6 mm×60 mm)，日本日立公司；LG10-24A變速臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；R5真空泵，德國(guó)普立；DHG-9035A恒溫干燥箱，北京恒泰豐科；酸度計(jì)(附磁力攪拌器)，凱氏燒瓶；冷凝器；氮球。

1.3 方法

1.3.1 醬油中的游離氨基酸分析方法

參照《食品中氨基酸的測(cè)定GB 5009.124—2003》[4]。

1.3.2 醬油中可溶性無鹽固形物含量檢測(cè)

參照《釀造醬油GB 18186—2000》6.2可溶性無鹽固形物部分；全氮含量檢測(cè)參照《釀造醬油GB 18186—2000》6.3全氮部分；氨基酸態(tài)氮含量檢測(cè)參照《釀造醬油GB 18186—2000》6.4氨基酸態(tài)氮部分[5]。

1.3.3 醬油低聚肽含量檢測(cè)

參照《海洋魚低聚肽粉 GB/T 22729-2008》6.3低聚肽部分[6]。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

1.4.1 游離氨基酸對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值的轉(zhuǎn)換計(jì)算方式

非酸性氨基酸對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值=氨基酸含量/氨基酸分子量×14

酸性氨基酸對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值=氨基酸含量/氨基酸分子量×14×2

1.4.2 低聚肽對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值的轉(zhuǎn)換計(jì)算方式

分子質(zhì)量140 Da以下低聚肽對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值=低聚肽含量/平均分子質(zhì)量140×14

分子質(zhì)量140～500 Da以下低聚肽對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值=低聚肽含量/平均分子質(zhì)量320×14

分子質(zhì)量500～1 000 Da以下低聚肽對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值=低聚肽含量/平均分子量750×14

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸的含量分析

采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)3個(gè)樣品中的17種氨基酸的種類和含量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見表2。3個(gè)樣品的氨基酸總量分別為3.875 g/100 mL、6.041 g/100 mL和2.341 g/100 mL，2號(hào)樣品最高；但考慮2號(hào)樣品配料表中明確標(biāo)注添加谷氨酸鈉，排除谷氨酸干擾后，3款醬油的氨基酸總量分別為3.494 g/100 mL、3.062 g/100 mL和2.106 g/100 mL，無添加的1號(hào)樣品氨基酸總量最高。

釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%，超過此范圍多為外添加谷氨酸鈉增鮮劑所致[7-8]。本研究中3個(gè)樣品的谷氨酸占比分別為9.83%、49.31%和10.04%，2號(hào)樣品谷氨酸占比超出常規(guī)范圍近1倍，對(duì)照其配料表推斷與其添加的谷氨酸鈉和各類增鮮劑相關(guān)。谷氨酸鈉成本低廉，谷氨酸作為釀造醬油的特征氨基酸，其含量及占比范圍可用作初步判斷產(chǎn)品是否添加增鮮劑的指標(biāo)之一。

表2 釀造醬油樣品中的氨基酸組成 (g/100 mL) (n=3, X±sd)Table 2 Free amino acids composition of fermentedsoy sauce

注：*必需氨基酸

在所檢測(cè)的16種氨基酸中(不計(jì)谷氨酸)，13種氨基酸在1號(hào)樣品中含量最高，此外甘氨酸和組氨酸在1號(hào)和2號(hào)樣品中基本無差異，只有天冬氨酸在2號(hào)樣品中的含量顯著高于1號(hào)樣品，3號(hào)樣品游離氨基酸含量普遍偏低。有研究表明，在配制醬油和植物蛋白水解液中天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸4種氨基酸含量接近，占總氨基酸(不計(jì)谷氨酸)比例的總和較高，分別為47.85%和55.52%[8]；本研究中的3個(gè)樣品4種氨基酸占比總和分別為25.41%、26.88%和25.02%，與前期研究中釀造醬油的含量27.42%相符[9]，且4種氨基酸間的含量差異性較大，表明3款醬油確為釀造醬油。

在排除谷氨酸干擾下，3個(gè)樣品的氨基酸種類分布基本一致，亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量分布在9%～11%范圍內(nèi)，是釀造醬油中的主要氨基酸；丙氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、甘氨酸分別分布在6%～9%和3%～6%范圍內(nèi)；胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和精氨酸含量一般低于3%。天冬氨酸在3款醬油中含量差異較大，2號(hào)醬油含量最高，是1號(hào)和3號(hào)樣品的1.71和1.83倍。

圖1 釀造醬油樣品中各氨基酸占總氨基酸的百分比(以谷氨酸計(jì))
Fig.1 Free amino acids proportion in fermented soy sauce (including glutamic acid)

2.2 必需氨基酸組成分析

3個(gè)樣品中必需氨基酸總量分別為2.08、1.76和1.12 g/100 mL，其中，無添加的1號(hào)樣品必需氨基酸占比最高為53.65%，2號(hào)樣品最低為29.18%；在排除谷氨酸后，3個(gè)樣品的必需氨基酸占比基本一致。根據(jù) WHO/FAO 提出的理想蛋白質(zhì)中 E/T 為 40%左右，E/N 在 60%以上的要求[9]，樣品1中氨基酸的組成最理想，7種必需氨基酸含量均高于2號(hào)和3號(hào)樣品，是2號(hào)樣品的1.08～1.27倍，3號(hào)樣品的1.48～2.19倍。

表3 釀造醬油中必需氨基酸總量占總氨基酸含量的百分比(n=3, X±sd)Table 3 Essential amino acids proportion in fermentedsoy sauce

注：EAA必需氨基酸總量， E/T必需氨基酸總量/氨基酸總量，E/N必需氨基酸/非必需氨基酸。

圖2 釀造醬油樣品中各必需氨基酸含量
Fig.2 Essential amino acids content in fermented soy sauce

賴氨酸是幫助其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被人體充分吸收和利用的關(guān)鍵物質(zhì), 科學(xué)家稱其是人體“第一必需氨基酸”和“最特別的、不可缺少的氨基酸”，其在谷物食品中含量較低，且易被破壞，故被稱為第一限制性氨基酸[10]。本研究中3個(gè)樣品的賴氨酸含量分別為0.35、0.28和0.16 g/100 mL，占總氨基酸的9.14%、4.62%和6.92%，其中1號(hào)分別是2號(hào)樣品和3號(hào)樣品的1.98倍和1.32倍。由此可見，釀造醬油中的必需氨基酸種類和含量均很豐富，在無外添加氨基酸的情況下通過釀造工藝即可達(dá)到均衡的分布水平，更符合人體的需求。

2.3 氨基酸態(tài)氮組成

依照國(guó)標(biāo)GB 18186—2000《釀造醬油》方法對(duì)3個(gè)樣品的氨基酸態(tài)氮、全氮和可溶性無鹽固形物進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果表明3款醬油的等級(jí)均與其產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)注相符，1號(hào)和2號(hào)樣品為特級(jí)醬油，3號(hào)樣品為三級(jí)醬油。其中2號(hào)醬油氨基酸態(tài)氮最高為1.42 g/100mL，比1號(hào)無添加特級(jí)醬油高0.48 g/100mL。

由于氨基酸態(tài)氮現(xiàn)已成為評(píng)判釀造醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，因此對(duì)其構(gòu)成的剖析顯得尤為重要。氨基酸態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，主要由游離氨基酸和小分子低聚肽中的氮元素構(gòu)成，國(guó)標(biāo)中采用甲醛法滴定得到氨基酸態(tài)氮的檢測(cè)值，結(jié)果見表4。將17種游離氨基酸和低聚肽的檢測(cè)結(jié)果換算為以氮元素計(jì)的氨基酸態(tài)氮值，得到三款醬油中氨基酸態(tài)氮的組成結(jié)構(gòu)，所有單品種游離氨基酸和小分子低聚肽對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)分布見圖3。

表4 釀造醬油中氨基酸態(tài)氮、全氮和可溶性固形物的檢測(cè)結(jié)果和氨基酸態(tài)氮組成分析(n=3, X±sd) 單位：g/100mL

注：氨基酸態(tài)氮檢測(cè)值(不計(jì)谷氨酸)=氨基酸態(tài)氮檢測(cè)值-谷氨酸貢獻(xiàn)值

圖3 釀造醬油中氨基酸態(tài)氮的主要構(gòu)成
Fig.3 Amino nitrogen composition in fermented soy sauce

從結(jié)果可知，3個(gè)樣品的氨基酸態(tài)氮計(jì)算值(包括谷氨酸)分別為0.91、1.16和0.47 g/100 mL，1號(hào)和3號(hào)樣品的計(jì)算值與檢測(cè)值基本相符，說明這兩個(gè)樣品的氨基酸態(tài)氮主要由游離氨基酸和低聚肽貢獻(xiàn)，2號(hào)樣品的檢測(cè)值比計(jì)算值高0.26 g/100mL推斷其中仍有18.31%由大分子蛋白貢獻(xiàn)。

2號(hào)樣品氨基酸態(tài)氮檢測(cè)值最高為1.42 g/100mL，但其中0.57 g/100mL由谷氨酸貢獻(xiàn)，貢獻(xiàn)率高達(dá)40.14%；1號(hào)樣品和3號(hào)樣品的谷氨酸貢獻(xiàn)率僅為7.45%和9.52%。排除谷氨酸干擾不計(jì)后，2號(hào)樣品氨基酸態(tài)氮降至0.85 g/100mL，與1號(hào)樣品含量相當(dāng)。此外2號(hào)樣品全氮值亦為最高為1.97 g/100mL，比1號(hào)樣品高23.90%，但排除谷氨酸的貢獻(xiàn)值后比1號(hào)樣品反低7.90%。由此可見，2號(hào)樣品雖氨基酸態(tài)氮和全氮檢測(cè)值雖為最高，但主要由谷氨酸貢獻(xiàn)，且其中相當(dāng)部分為外源添加。

本研究中3個(gè)樣品的總游離氨基酸對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)值由高到低順序?yàn)?號(hào)樣>1號(hào)樣>3號(hào)樣，2號(hào)樣品為66.20%；但排除谷氨酸干擾后，1號(hào)和3號(hào)樣品的貢獻(xiàn)率變化不大，2號(hào)醬油的貢獻(xiàn)率下降至26.41%，比1號(hào)樣品低18.62%。

釀造醬油的主要原料大豆或黃豆中的大豆蛋白在經(jīng)過多種微生物區(qū)系和酶系的分解作用下生成豐富的游離氨基酸和低聚肽，其中分子質(zhì)量1 000 Da以下的小分子低聚肽是預(yù)消化的蛋白質(zhì)，可直接吸收，并且在酸性環(huán)境或加熱處理的情況下，仍保持穩(wěn)定，不會(huì)被破壞。比大分子蛋白質(zhì)更易消化，吸收利用率更高，營(yíng)養(yǎng)作用更強(qiáng)。在本研究中，1號(hào)樣品3類小分子低聚肽對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)均高于另兩個(gè)樣品，總貢獻(xiàn)值分別是2號(hào)和3號(hào)樣品的1.95倍和2.39倍。

上述結(jié)果均表明，氨基酸態(tài)氮含量高并不一定代表氨基酸、低聚肽類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，外部添加的增鮮劑如谷氨酸鈉也會(huì)對(duì)這一表征指標(biāo)有顯著影響。3款釀造醬油在排除谷氨酸干擾后，1號(hào)和2號(hào)兩款特級(jí)醬油氨基酸含量基本相等，均顯著高于3號(hào)的三級(jí)醬油，但三個(gè)樣品氨基酸的分布趨勢(shì)基本一致。研究表明，無增鮮劑外添加的釀造醬油氨基酸態(tài)氮基本可達(dá)到0.8 g/100 mL的特級(jí)水平，但能超過1.0 g/100 mL的產(chǎn)品卻非常少，醬油中主要的含氮成分是游離氨基酸及肽，其中游離氨基酸占50%～75%，肽占15%～35%，還有部分為銨態(tài)氮[11-12]。游離氨基酸和低聚肽做為醬油主要的營(yíng)養(yǎng)成分和呈味物質(zhì)，其組成成分和比例直接影響醬油的品質(zhì)。

對(duì)于消費(fèi)者知道來說，氨基酸態(tài)氮的高低是辨別醬油優(yōu)劣等級(jí)最直觀也是最重要的一個(gè)指標(biāo)。正常條件下，提高醬油等級(jí)和品質(zhì)，增加氨基酸態(tài)氮含量需要篩選更優(yōu)質(zhì)的原料、提升釀造工藝和增加發(fā)酵時(shí)間，但隨之會(huì)大大提高生產(chǎn)成本；另有部分企業(yè)通過添加成本遠(yuǎn)低于釀造醬油的味精，以增加氨基酸態(tài)氮含量，增鮮、提級(jí)、降成本三不誤，且其屬于國(guó)家允許的添加劑，因此眾多特級(jí)醬油都有可能是添加有谷氨酸鈉成分的“加料醬油”[13]。在以往的研究中多關(guān)注釀造醬油的真?zhèn)舞b別，而在符合釀造醬油標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品中如何正確認(rèn)識(shí)氨基酸態(tài)氮數(shù)值的指征含義以及現(xiàn)有釀造醬油等級(jí)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系是否可以滿足市場(chǎng)發(fā)展的要求方面探討尚有欠缺，本研究從氨基酸態(tài)氮的組成解析角度提出了新的研究思路。

3 結(jié)論

通過對(duì)3個(gè)釀造醬油樣品的氨基酸含量、構(gòu)成和氨基酸態(tài)氮組成分析，結(jié)果表明2號(hào)樣品雖然各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)最高，但排除谷氨酸干擾后均低于無添加的1號(hào)樣品，2號(hào)樣品谷氨酸對(duì)氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)率高達(dá)40.14%。谷氨酸做為醬油中最主要的鮮味氨基酸，其含量范圍可用于初步判定產(chǎn)品是否外添加增鮮劑。不計(jì)谷氨酸后，3款釀造醬油各氨基酸含量相對(duì)分布均勻。目前醬油產(chǎn)品包裝中標(biāo)注的氨基酸態(tài)氮雖均能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但僅以此來衡量醬油品質(zhì)并不能準(zhǔn)確全面地體現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量。