商飛　于魯敏　薛挺

【摘 要】本實驗通過抗生素在體外和體內(nèi)抑制金黃色葡萄球菌生長實驗闡述了其實驗目的、實驗原理、實驗步驟以及數(shù)據(jù)處理和實驗注意事項。此外，梯度稀釋法、紙片法以及稀釋涂平板等基礎的實驗操作是從事微生物科學研究的初級工作人員必須掌握的實驗技能。

【關鍵詞】抑菌；抗生素

中圖分類號： S336 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2018）06-0086-002

1 實驗意義

本綜合實驗項目作為微生物學實驗的補充和深入，選擇抗生素為實驗材料，主要內(nèi)容包括抗生素的體外抑菌實驗、抗生素的體內(nèi)抗菌實驗，形成一個整體的綜合性實驗。在實驗內(nèi)容上強調(diào)系統(tǒng)性、專業(yè)性、實用性和趣味性；涉及微生物學專業(yè)多項技術原理、復雜流程，將整體實驗課程的水平從分散的基礎實驗提升到綜合性、系統(tǒng)性更高的層次，對學生的動手能力、專業(yè)水平、科研素質(zhì)等進行全面的培養(yǎng)和提高，此即本項目設計的意義所在。

2 實驗目的

（1）了解常用抗菌藥物的抗菌作用及抗菌范圍，并掌握抗菌藥物的某些體外抗菌實驗；

（2）觀察血液、細菌、藥物三者相互作用，以加深學生對抗菌藥物藥理作用的認識；

（3）通過理論聯(lián)系實際的學習和操作訓練，訓練學生掌握醫(yī)學微生物學綜合實驗技能和實驗技巧，提高動手能力，有助于學生科學世界觀的形成；

（4）培養(yǎng)學生獨立操作、分析解決問題的能力，提高對微生物學的興趣，為學生獨立創(chuàng)業(yè)提供一些創(chuàng)業(yè)技能思路。

3 實驗原理

金黃色葡萄球菌是機會致病菌，而抗菌藥物在一定濃度下對其有抑制和殺滅作用?？咕幬镆话闶侵妇哂幸志驓⒕钚缘乃幬?，包括各種抗生素、磺胺類、咪唑類、硝基咪唑類、喹諾酮類等化學合成藥物。由細菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)培養(yǎng)而得到的某些產(chǎn)物，或用化學半合成法制造的相同或類似的物質(zhì)，也可化學全合成。

藥物的體外抑菌實驗，是指在體外測定藥物抑制或殺滅細菌能力的實驗。它是常用抗菌實驗的方法，其中最常用的方法有系列稀釋法和瓊脂擴散法。

稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種，這兩種方法都可以用來測定藥物的最小抑菌濃度（MIC）：是指該藥物能抑制細菌生長的最低濃度，通常用？滋g/mL或U/mL表示。其結果判斷方法為凡無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為該菌的最小抑菌濃度（MIC）。

瓊脂擴散法是將抗菌藥物加至接種試驗菌的平板表面，抗菌藥物在瓊脂膠內(nèi)向四周自由擴散，其濃度隨擴散距離增大而降低。在藥物一定的擴散距離內(nèi)，由于藥物的抗菌效應，試驗菌不能生長，此無菌生長的范圍稱為抑菌圈。抑菌圈的大小與藥物的抑菌效應成正比。瓊脂擴散法常有紙片法、管碟法、打洞法和挖溝法。一般藥敏實驗常采用紙片法，我們可以根據(jù)抑菌圈的大小，來判斷菌種對藥物的敏感性，是敏感，中度敏感還是耐藥。

藥物的體內(nèi)抗菌實驗又稱為動物實驗治療試驗或保護力試驗。當抗菌藥物進入機體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)或磷脂、濃汁內(nèi)的核酸均與藥物結合，降低藥物的活性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的活性。機體內(nèi)的微生物代謝活動較低，對藥物的敏感性降低，有時還可以形成細胞壁缺陷型細菌，對某些藥物不敏感。機體內(nèi)各組織中藥物的吸收、分布不同，使藥物的濃度難以恒定。因此在評定新藥的藥效時除做體外抑菌實驗外還需要做體內(nèi)的抗菌實驗。

4 實驗操作

4.1 實驗材料與用品

材料：宿主（兔、雞等）經(jīng)抗凝處理后血液全血組分，人工培養(yǎng)的人單核巨噬細胞U937，金黃色葡萄球菌209-P（或NCTC8325）標準株。

器材：滅菌EP管（EP管），EP管架，新鮮全血，槍頭（黃、白、藍），微量移液器（10？滋L，100？滋L，1mL），滅菌小棉簽，小鑷子，圓形濾紙（直徑為6 mm），培養(yǎng)皿，紫外分光光度計，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)板。

藥品與試劑：青霉素，鏈霉素，四環(huán)素，氯霉素，紅霉素，碘酊，檸檬酸鈉，75%酒精，PBS緩沖液。

4.2 培養(yǎng)基的制備

（1）TSB+agar培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯粉末30.0g，NaCl 30.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，瓊脂20.0g，溶化后分裝，121℃滅菌15min備用。

（2）TSB肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯粉末30.0g，NaCl 30.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，121℃滅菌15min備用。

4.3 抗菌藥物的體外抑菌實驗

4.3.1 試管法

（1）取滅菌EP管10只，按1-10編號，排列于EP管架上。無菌操作，分別加入TSB肉湯培養(yǎng)基0.5mL。用微量移液器吸取40U/mL的青霉素藥液0.5mL放入第1管，并反復吸勻。從第1管吸出0.5mL放入第2管，吸勻后吸出0.5mL放入第3管，依此法逐管進行稀釋至第9管。第10管不加藥液作為對照管。

（2）各EP管加入0.5mL新鮮配置的稀釋濃度為10-4的金黃色葡萄球菌209-P菌液，放入孵箱內(nèi)于37℃孵育24h后取出，觀察細菌生長情況并將結果記錄于表中。細菌不生長的最小濃度為青霉素對金黃色葡萄球菌的MIC。

（3）其余抗菌藥物均按上述方法測定對金黃色葡萄球菌209-P的MIC。

4.3.2 紙片法

（1）以滅菌小棉簽蘸取金黃色葡萄球菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液，然后輕輕地從4個不同方向平行交叉劃線，使菌液均勻涂布于整個瓊脂平板表面。

（2）取2000U/mL的青霉素、2000μg/mL的鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、2.5%的碘酊各2 mL分裝于試管中。用無菌小鑷子取圓形濾紙12張，每兩張浸于同一種藥液中，浸透后取出，瀝去過多的藥液。將2片含一種藥液的濾紙分別放在已接種細菌的瓊脂平板表面的不同區(qū)域。為了位置間隔準確，最好事先在皿底用標記筆做上記號。

（3）將培養(yǎng)皿放入孵箱內(nèi)于37℃孵育24 h，觀察紙片周圍有無抑菌圈，將結果記錄于表中。測量抑菌圈的直徑，比較各藥的抗菌效力。

4.4 抗菌藥物的體內(nèi)抗菌實驗

4.4.1 接種法及細菌存活測試

（1）金黃色葡萄球菌各菌株劃線至TSB + agar平板上培養(yǎng)>16h；

（2）從板上挑取多個克隆到含有PBS的EP管中，離心收集菌，用PBS洗滌兩遍后調(diào)菌液濃度至吸光度OD600=0.6，稀釋100倍后取100？滋L菌液和lmL全血混合37℃搖床培養(yǎng)。

（3）分別在0h，1h，3h，5h，7h，9h時間點取100？滋L混合培養(yǎng)液，用無菌水稀釋10倍、100倍、1000倍涂平板，放置37℃培養(yǎng)20 h后，計數(shù)生長出來的細菌克隆數(shù)，以0 h的克隆數(shù)作為對照，計算存活率，作圖。

4.4.2 抗生素體內(nèi)治療干預實驗

（1）依據(jù)步驟4.3.1體外抗菌實驗的得到的各抗生素的最小抑菌濃度值，配制各種常用抗生素合適濃度的母液。

（2）金黃色葡萄球菌各菌株劃線至TSB+agar平板上培養(yǎng)>16h；

（3）從板上挑取多個克隆到含有PBS的EP管中，離心收集菌，用PBS洗滌兩遍后調(diào)菌液濃度至吸光度OD600=0.6，稀釋100倍后取100？滋L菌液和l mL全血混合，再加入工作濃度的各種抗生素，37℃搖床培養(yǎng)。

（4）分別在0h，1h，3h，5h，7h，9h時間點取100？滋L混合培養(yǎng)液，用無菌水稀釋10倍、100倍、1000倍涂平板，放置37℃培養(yǎng)20 h后，計數(shù)生長出來的細菌克隆數(shù)，以0 h的克隆數(shù)作為對照，計算存活率，作圖。

5 注意事項

（1）充分滅菌的槍頭和EP管應當烘干后使用，避免槍頭和EP管中殘余的水株對稀釋結果產(chǎn)生影響。

（2）菌液稀釋時，確保正確使用移液器，確保吸取的菌液體積正確。

（3）用移液槍吸取較為粘稠的血液時，動作應當輕柔緩慢，以免血液進入槍管，影響移液槍使用。

（4）使用滅菌小棉簽蘸取金黃色葡萄球菌液涂布瓊脂平板表面時，棉簽蘸取菌液后應當在EP管壁上碾壓一下，避免涂布后在平板上留下過多菌液，長成較厚菌苔進而影響后期抑菌圈觀察。

（5）菌液涂布時，應當在平板上均勻涂布，避免留下空白區(qū)域，影響抑菌圈大小測定。

（6）在進行紙片法測定抑菌效果時，含有抗生素的濾紙片應當貼在事先劃好區(qū)域的中央，避免抑菌圈交叉對后續(xù)觀察實驗的影響。

（7）濾紙片應當輕輕貼附在平板表面，可用無菌的鑷子輕輕按壓，切勿造成固體瓊脂的破裂和變形，以免影響抑菌圈的大小和形狀。

（8）涂布器在涂布前應當使用酒精燈外焰充分灼燒，在無菌區(qū)內(nèi)晾涼后進行涂布實驗，避免涂布器溫度過高燙死細菌，影響實驗數(shù)據(jù)。

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