李小偉 ，張宏濤，張澤婧

1.寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)重建省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

西藏沙棘（Hippophae tibetanaSchlecht.）是胡頹子科沙棘屬植物，是分布于青藏高原東南緣的一種高山灌木，能與弗蘭克氏菌共生固氮，是人工造林的主要先鋒樹(shù)種（廉永善，2000）。其海拔分布范圍為2800～5200 m，主要生長(zhǎng)在沙質(zhì)土壤的河岸或山坡，山谷和高山草甸。近年來(lái)，沙棘屬植物引起了全世界的關(guān)注，主要是因?yàn)樗哂休^高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（Vahid et al.，2004；Tom et al.，2009；Yang et al.，2009；Geetha et al.，2011）。在傳統(tǒng)藏藥和蒙藥中，沙棘屬植物被用于治療病人；在 20世紀(jì) 50年代以來(lái)，在亞洲和歐洲逐漸出現(xiàn)了許多源于栽培和野生的沙棘醫(yī)藥產(chǎn)品，以中國(guó)和俄羅斯尤為常見(jiàn)（廉永善，2000）。

目前，大量植物化學(xué)研究表明，沙棘屬植物葉片含有有益于人體健康的黃酮物質(zhì)（廉永善，2000），具有重要的藥用價(jià)值，在醫(yī)藥和保健品產(chǎn)業(yè)中被廣泛使用（Vahid et al.，2004）。沙棘黃酮能夠增強(qiáng)心臟收縮和舒張功能，具有抗心率失常、抗心肌缺氧缺血、增強(qiáng)免疫、降低血清膽固醇，同時(shí)還具有抗腫瘤、老化和消炎等廣泛的藥理功效（廉永善，2000；Gupta et al.，2006；Mishra et al.，2008；Geetha et al.，2009）。黃酮物質(zhì)主要以苷元的形式存在于沙棘屬植物的葉子和果實(shí)中（Chen et al.，2013）。以往對(duì)中國(guó)沙棘和西藏沙棘葉片黃酮的研究表明：兩種沙棘葉在黃酮成分組成上差異較小，總黃酮由以楊梅素（Myrica）、槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和異鼠李素（Isorhamnetin）為主要苷元的數(shù)十種黃酮苷類化合物所組成（Vahid et al.，2004；秦振嫻等，2016；洪道鑫等，2017）。槲皮素是人類營(yíng)養(yǎng)譜中的一個(gè)主要的糖苷配基，被認(rèn)為是一種有效的自由基清除劑，對(duì)幾種類型的癌癥和心血管疾病具有藥理功效（Knekt et al.，2002）。山奈酚具有強(qiáng)抗氧化性，可降低冠狀動(dòng)脈心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)（Kim et al.，2008）。異鼠李素在人心血管疾病方面亦具有療效（Ibarra et al.，2003）。

沙棘葉片中總黃酮的組成和含量會(huì)受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響，藥材品質(zhì)亦會(huì)受到間接影響（蘇錦松等，2017）。然而，目前沒(méi)有學(xué)者系統(tǒng)地研究過(guò)西藏沙棘黃酮組成和含量與環(huán)境因子的關(guān)系。鑒于上述原因，本研究以西藏沙棘葉片為研究材料，借助高效液相色譜（RP-HPLC）檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定4種主要黃酮含量，研究黃酮含量與生態(tài)因子的關(guān)系，以揭示影響西藏沙棘葉片黃酮含量的主要生態(tài)因子。

1 材料與方法

1.1 樣地設(shè)置

根據(jù)西藏沙棘在青藏高原的自然分布情況，選取了 26個(gè)自然種群作為樣地，整個(gè)樣地位于青藏高原東南部，包括甘肅、青海省、四川3個(gè)省區(qū)，地理位置為緯度 31°～38°N，經(jīng)度 99°～103°E，海拔2890～4046 m（圖 1）。

1.2 樣品的采集

于2011年8月進(jìn)行植物樣品的采集，在每個(gè)樣地選取30個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體采集5片葉片，葉片均向陽(yáng)成熟且生長(zhǎng)良好，沒(méi)有病、蟲(chóng)斑。

1.3 樣品的測(cè)定

1.3.1 儀器和試劑

美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀，由自動(dòng)脫氣系統(tǒng)、全自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、Chem stations色譜工作站組成。RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司），AR-2140型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），KQ-160TDE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。HPLC用Fisher公司生產(chǎn)的色譜純甲醇試劑，水為雙蒸水；其余所用試劑均為分析純。

1.3.2 對(duì)照品

楊梅素（529-44-2，純度98%）、槲皮素（批號(hào)117-39-5，純度98%）、山奈素（批號(hào)520-18-3，純度98%）和異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)480-19-3，純度98%）。

1.3.3 色譜條件

美國(guó) Agilent 1100高效液相色譜儀，Welch Ultimate?AQ-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm；柱溫25 ℃；流動(dòng)相由甲醇（A）、乙腈（B）、0.1%磷酸溶液組成（C），采用梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間 24 min；進(jìn)樣量 10 μL，流速為 1 mL·min-1。其梯度洗脫條件如下：0～10 min，12% A，20% B，68% C；10～18 min，52% A，48%C；18～24 min，72% A，28% C。在此色譜條件下，樣品中各組分的色譜峰分離度良好。

1.3.4 供試樣品溶液的制備

圖1 本研究西藏沙棘采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of Hippophae tibetana Schlecht. in this study

取適量冷藏的沙棘葉片樣品，在研缽中磨細(xì)，并過(guò)100目篩。在50 ℃下真空干燥4 h。稱取1 g沙棘細(xì)粉于50 mL三角瓶中，加入30 mL 70%甲醇，在功率為80 W、水溫為30 ℃的條件下超聲提取30 min，提取液冷卻至室溫后進(jìn)行抽濾，重復(fù) 3次，合并濾液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮濾液精密量取濾液15 mL于 100 mL圓底燒瓶中，加入 22.5 mL 2 mol·L 鹽酸，在95 ℃條件下加熱回流45 min后冰浴，冷卻后加入11.25 mL異戊醇（Isoamylalkohol，IAA）進(jìn)行萃取，劇烈晃動(dòng)，使上相和下相分離，用移液槍吸取上相液體（含有水解的黃酮類物質(zhì)），甲醇定容于50 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試溶液（Zhang et al.，2005；Zu et al.，2006）。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別稱取10 mg槲皮素、2.5 mg山奈素和10 mg異鼠李素、1 mg楊梅素對(duì)照品于燒杯中，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，分別配得0.2、0.05、0.2、0.02 mg·mL-1對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行濃度梯度稀釋。吸取 10 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照品槲皮素、山奈酚、異鼠李素和楊梅素進(jìn)樣濃度-峰面積均呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

1.4 氣象數(shù)據(jù)獲取

根據(jù)每個(gè)采樣點(diǎn)的地理坐標(biāo)，從全球氣象數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.worldclim.org）獲?。℉ijmans et al.，2005）氣象數(shù)據(jù)，主要包括年均溫度、年均降雨量、年平均最低溫、年平均最高溫、風(fēng)速、1月平均溫度、7月平均氣溫、水蒸汽壓。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS（IBM，Chicago，IL，USA；2008）對(duì)西藏沙棘葉片黃酮平均值、分布范圍、變異特征和正態(tài)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用Canoco 4.5軟件中的冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）方法分析西藏沙棘葉片黃酮含量與生態(tài)因子之間的相互關(guān)系。顯著度水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 西藏沙棘葉片黃酮含量特征

西藏沙棘葉片中楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均含量分別為(0.13±0.07)、(2.00±0.50)、(1.08±0.29)、(3.51±0.54) mg·g-1。葉片楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均含量排序?yàn)椋寒愂罄钏兀鹃纹に兀旧侥畏樱緱蠲匪兀ㄒ?jiàn)表2、表3）。

2.2 西藏沙棘葉片黃酮含量與氣候因子的關(guān)系

不同種群沙棘黃酮含量與生態(tài)因子 RDA排序（如圖 2所示）結(jié)果顯示，第一和第二主軸分別解釋了西藏沙棘黃酮變量57.6%和2.3%的方差。圖中箭頭越長(zhǎng)，表示對(duì)黃酮含量的解釋量越大。箭頭之間的角度代表了變量間的相關(guān)性。因此，西藏沙棘總黃酮、異鼠李素、槲皮素和楊梅素含量與海拔（F=9.723，P=0.006）、1 月氣溫（F=5.525，P=0.014）、年均降雨量（F=5.425，P=0.022）、水蒸汽壓（F=3.682，P=0.048）呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，而與年平均最低溫（F=3.621，P=0.06）、年均溫度（F=3.279，P=0.074）、年平均最高溫（F=2.800，P=0.096）和7月氣溫（F=0.753，P=0.424）呈不顯著正相關(guān)關(guān)系；與緯度（F=8.632，P=0.004）、風(fēng)速（F=2.830，P=0.090）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；而西藏沙棘葉片山奈酚對(duì)生態(tài)因子的響應(yīng)不同于其他3種黃酮，與經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（F=0.301，P=0.692）。

3 討論

本研究采用化學(xué)成分分析和冗余分析統(tǒng)計(jì)方法探索了26個(gè)西藏沙棘種群4個(gè)黃酮成分對(duì)8個(gè)生態(tài)因子的響應(yīng)，明確了影響西藏沙棘葉片總黃酮、異鼠李素、槲皮素和楊梅素含量的主要因素依次是海拔、1月氣溫、年均降雨量、水蒸汽、緯度；而山奈酚隨生態(tài)因子無(wú)顯著的變化規(guī)律。

表1 4種對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table1 Standard curve of four reference substances

表2 西藏沙棘葉片楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素和總黃酮含量Table2 Leaf myrica, quercetin, kaempferol, isorhamnetin, total flavonoid content in Tibetan sea-buckthorn

表3 不同種群西藏沙棘葉片黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table3 Leaf flavonoid content in different Tibetan sea-buckthorn populations

圖2 不同種群沙棘黃酮含量與生態(tài)因子RDA排序圖Fig.2 RDA of flavonoid content and environment variables in different Tibetan sea-buckthorn populations

黃酮是一類植物重要的次生代謝產(chǎn)物，是植物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的，并在防御病原體，抵御食草動(dòng)物和環(huán)境脅迫方面起著重要的作用（Carlsen et al.，2008；Agati et al.，2011）。環(huán)境因素，如氣候和光照能夠決定植物的生長(zhǎng)，并影響著植物體內(nèi)黃酮的成分和含量（Ksouri et al.，2008；Murai et al.，2009）。因此，植物體內(nèi)黃酮類化合物的組成和含量高度可塑，與其生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)（Susanne et al.，2010）。

海拔對(duì)植物體內(nèi)黃酮的累積起著重要作用，例如，不同海拔的中國(guó)沙棘葉片黃酮含量與海拔呈顯著正相關(guān)關(guān)系（蘇錦松等，2017）。海拔是一個(gè)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和分布的間接因素，隨著海拔的升高，氣候逐漸變得惡劣，降水增多，年均溫度下降，而輻射增強(qiáng)，其中以水分、溫度和紫外輻射等生態(tài)因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育影響最為顯著（祝青林等，2005）；本研究結(jié)果表明，高海拔地區(qū)西藏沙棘葉片富含較多的黃酮，說(shuō)明惡劣的環(huán)境條件有利于西藏沙棘葉片黃酮的富集。諸多生態(tài)因子中，目前已有研究證實(shí)：黃酮類物質(zhì)如槲皮素、楊梅素、山奈酚和異鼠李素以及花青素可以充當(dāng)紫外吸收物質(zhì)，具有防輻射功能，尤其是在葉表皮細(xì)胞中的積累，可以保護(hù)葉片內(nèi)部組織，減少UV-B損傷（Nybakken et al.，2004；Treutter，2006），葉黃酮的累積可以提高自身的適合度；槲皮素、山柰酚、異鼠李素和楊梅素是西藏沙棘常見(jiàn)的黃酮苷元（秦振嫻等，2016），它們的衍生物主要以糖苷的形式存在于西藏沙棘葉片細(xì)胞的液泡中。為了更好地適應(yīng)當(dāng)?shù)貝毫拥沫h(huán)境，必然分配大量的資源用于葉片黃酮的合成以充當(dāng)UV-B的吸收物質(zhì)，而不用于植物生長(zhǎng)和繁殖。

1月氣溫高低影響著西藏沙棘的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響葉黃酮累積，它是一個(gè)限制因素；而年均降水量最主要的決策因素，降水量的多少很大程度決定著土壤蒸發(fā)量和植物蒸騰作用的強(qiáng)弱，充足的水分供給是西藏沙棘維持正常生長(zhǎng)發(fā)育和生理活動(dòng)的重要保障，也是葉片次生代謝產(chǎn)物積累的前提條件。蘇錦松等（2017）對(duì)同屬植物中國(guó)沙棘葉片黃酮的研究表明：雖然影響中國(guó)沙棘葉片槲皮素、異鼠李素、山柰酚生態(tài)因子各有差異，但是總體都以海拔和降雨量占主導(dǎo)，這與本文部分研究結(jié)果一致。

4種黃酮苷元中，槲皮素、楊梅素和異鼠李素含量隨空間和氣候因子顯示出一致的變化規(guī)律，但是山奈酚含量沒(méi)有表現(xiàn)出任何規(guī)律。Ryan et al.（1998；2014）發(fā)現(xiàn)模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和牽?；ǎ≒harbitis nil）對(duì)UV-B輻射的響應(yīng)和其他植物有差異，隨著UV-B輻射逐漸升高，植物體內(nèi)槲皮素/山奈酚的比率呈變大趨勢(shì)，由此推斷，槲皮素對(duì)UV-B輻射比山奈酚敏感，槲皮素對(duì)UV-B輻射更高效。西藏沙棘葉片山奈酚含量隨空間和氣候因子無(wú)顯著規(guī)律，可能是由山奈酚對(duì)UV-B輻射響應(yīng)的差異造成的，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

西藏沙棘葉片楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均含量分別為 0.13、2.00、1.08、3.51 mg·g-1。西藏沙棘葉片總黃酮含量與海拔、1月氣溫、年均降雨量和水蒸汽壓呈顯著正相關(guān)關(guān)系；與緯度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；說(shuō)明高海拔地區(qū)有利于西藏沙棘葉片黃酮的富集。山奈酚與槲皮素、楊梅素和異鼠李素對(duì)生態(tài)因子的響應(yīng)不一致。

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