孫許超，郭彥海，張士兵，錢雅潔，劉振鴻，薛罡，高品

東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620

土壤氮循環(huán)是土壤物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等，其中微生物硝化-反硝化作用在生態(tài)氮循環(huán)過程中占重要地位。硝化作用是將NH3氧化成NO2-，再氧化成NO3-的過程，參與該過程的微生物主要為氨氧化細(xì)菌（由氨單加氧酶amoA基因編碼）和硝酸細(xì)菌（由亞硝酸鹽氧化還原酶nxr基因編碼）；反硝化作用是將NO3-最終還原成N2的過程，主要由反硝化細(xì)菌完成，包括NO3-還原（由narG或napA基因編碼）、NO2-還原（由nirS或nirK基因編碼）、NO還原（由norB基因編碼）和N2O還原（由nosZ基因編碼）。雖然目前已有較多針對農(nóng)田、林地和草地等土壤生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)特定關(guān)鍵過程功能基因變化特征及環(huán)境影響因子的研究報(bào)道（高嵩涓等，2017；洪晨等，2014；張晶等，2009），如高嵩涓等（2017）采用熒光定量 PCR（qPCR）法研究了紅壤稻田中不同時(shí)期AOA-amoA、narG和nosZ基因豐度變化，發(fā)現(xiàn)土壤理化性質(zhì)對其具有重要影響，但關(guān)于垃圾焚燒廠周邊土壤重金屬累積污染對硝化-反硝化功能基因的變化影響規(guī)律方面的研究還很少（鐘山等，2014）。

本研究以上海某垃圾焚燒廠周邊草地表層土壤為研究對象，采用qPCR法定量分析不同硝化和反硝化功能基因豐度，包括 AOB-amoA、nxrB、narG、nirS、norB和nosZ基因，探討土壤重金屬累積污染及其理化性質(zhì)對硝化和反硝化功能基因豐度變化的作用影響，為進(jìn)一步掌握重金屬污染對土壤氮循環(huán)功能微生物的影響規(guī)律提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究區(qū)為上海某生活垃圾焚燒廠周邊區(qū)域，經(jīng)實(shí)地考察，在綜合考慮研究區(qū)地形分布、土壤類型、氣象參數(shù)及交通網(wǎng)絡(luò)等特征的基礎(chǔ)上，以垃圾焚燒廠為中心，在半徑4 km范圍內(nèi)主要采集草地0～20 cm表層土壤，共布設(shè)21個(gè)采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)具體位置如圖1所示。采樣過程中盡量避開外來土和近期被擾動(dòng)過的土層，按梅花形布點(diǎn)方法進(jìn)行采樣，在5 m×5 m正方形區(qū)域中心點(diǎn)和4個(gè)頂點(diǎn)分別采集等量土壤，混合均勻后作為1個(gè)樣品（約1 kg），裝入土樣采集袋中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室待分析。

1.2 土壤樣品預(yù)處理及理化分析

1.2.1 樣品預(yù)處理

所有土壤樣品先剔除植物根莖、沙礫等雜物，其中一部分保存于-20 ℃冷凍箱內(nèi)，以備后續(xù)分子生物學(xué)分析；另一部分置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)處自然風(fēng)干，研磨過100目篩網(wǎng)，然后貯存于土壤樣品瓶中，用于土壤理化性質(zhì)、重金屬含量測定等。為避免人為因素的干擾，土壤樣品在采集和預(yù)處理過程中均采用木鏟、木棒、瑪瑙研缽等器具。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)和重金屬總量測定

土壤 pH值采用 S210-K型 pH計(jì)（Mettler Toledo，瑞士）測定，測定時(shí)水土比控制為2.5∶1。土壤總有機(jī)碳（TOC）和總氮（TN）含量采用Multi N/C?3100型總有機(jī)碳/總氮分析儀（Analytikjena，德國）測定。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES，Perkin-Elmer，美國）測定土壤中Cd、Pb、Cu、Ni、Cr、Zn和As等7種重金屬含量，預(yù)處理使用HNO3-HCl-HF-H2O2微波消解。

1.3 目標(biāo)氮循環(huán)功能基因檢測

1.3.1 DNA提取

土壤總 DNA采用 TIANamp Soil DNA Kit（TIANGEN）進(jìn)行提取，提取步驟參照試劑盒操作說明書，所提取的DNA使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 2.0型核酸蛋白測定儀（Invitrogen，美國）檢測其純度和濃度。

1.3.2 氮循環(huán)功能基因檢測分析

本研究選取AOB-amoA、nxrB、narG、nirS、norB和nosZ基因作為研究對象，使用Bio-rad T100型普通 PCR優(yōu)化反應(yīng)條件并制備標(biāo)準(zhǔn)品。采用LightCycler?96型熒光定量qPCR（Roche，瑞士）對目標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測分析，所用擴(kuò)增引物序列、擴(kuò)增子大小和退火溫度見表 1。qPCR反應(yīng)體系總體積為 20 μL，包括 FastStart Essential DNA Green Master（Roche）10 μL，上下游引物（4 μmol·L-1）各 1.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 6 μL。熱循環(huán)反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)利用熔解曲線檢測分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每組樣品3個(gè)平行反應(yīng)，并以無菌水作為陰性對照。

目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)品委托生工生物工程（上海）有限公司合成，按梯度稀釋（10-2～10-7）后進(jìn)行qPCR反應(yīng)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（共6個(gè)稀釋點(diǎn)），各qPCR反應(yīng)擴(kuò)增效率在90%～99%之間，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99。

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖1 研究區(qū)域表層土壤采樣點(diǎn)位置示意圖Fig.1 Schematic of the surface soil sampling sites in the study area

表1 qPCR反應(yīng)所使用的基因引物信息Table1 Sequences of primers used for qPCR reaction

數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算因變量和自變量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)（r）和P值；顯著性檢驗(yàn)水平α=0.05，若P＜0.05，則認(rèn)為具有顯著的相關(guān)性，反之則認(rèn)為相關(guān)性不顯著。運(yùn)用ArcGIS 10.2軟件進(jìn)行空間分布分析，運(yùn)用Canoco 4.5軟件進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 研究區(qū)土壤理化性質(zhì)及重金屬含量分析

如表2所示，研究區(qū)所有采樣點(diǎn)土樣pH值在7.64～8.81之間，整體呈偏堿性。土壤TOC和TN含量范圍分別為 4.17～20.86 g·kg-1和 0.8～2.26 g·kg-1。史利江等（2010）針對上海市不同土地利用方式下的土壤TOC和TN含量水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草地土壤TOC平均含量約為10.05 g·kg-1，TN平均含量約為1.12 g·kg-1，與本研究結(jié)果相似。

由表 2可知，重金屬 Cd平均含量約為0.083～1.065 mg·kg-1，除采樣點(diǎn) NW2 外，其余采樣點(diǎn)均高于上海市土壤背景值（中國環(huán)境監(jiān)測總站，1990），其中E3采樣點(diǎn)超出背景值約6.7倍。大部分土樣中Cr（85.7%）、Cu（61.9%）、Pb（61.9%）、Ni（57.1%）和 Zn（81.0%）等重金屬平均含量均略高于上海市土壤背景值，但未超出《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB15618—1995）二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。所有土樣中As平均含量均未超過上海市土壤背景值。上述結(jié)果表明，研究區(qū)土壤已受到不同程度的重金屬污染，且以Cd污染最為嚴(yán)重。因此，本研究以《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB15618—1995）一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)值作為重金屬污染評(píng)價(jià)依據(jù)，計(jì)算 21個(gè)采樣點(diǎn)的內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)。結(jié)果表明，垃圾焚燒廠周邊西北方向W1和NW1采樣點(diǎn)土壤中Cd含量超出一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)3倍以上，屬于中度污染區(qū)域；類似地，采樣點(diǎn)NE1、NE2和S2周邊范圍屬于輕度污染區(qū)域，這可能與當(dāng)?shù)貧夂驐l件有關(guān)。研究區(qū)春夏季主導(dǎo)風(fēng)向?yàn)闁|南風(fēng)，受垃圾焚燒廠焚燒煙氣的影響，在其下風(fēng)向（NW）區(qū)域土壤受到一定程度的重金屬污染。此外，采樣點(diǎn)E3中Cd平均含量超出一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)約5倍，這主要是因?yàn)樵摬蓸狱c(diǎn)位于建筑工地和道路附近，除焚燒煙氣外，其受交通尾氣和建筑揚(yáng)塵等污染影響也較大。

表2 各采樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)及重金屬含量Table2 Physicochemical properties and heavy metal contents of each soil sample

采用ArcGIS 10.2反距離權(quán)重法分析重金屬空間分布特征，結(jié)果如圖 2所示。Cd、Zn、Pb、Cu和Ni在垃圾焚燒廠周邊含量較高，隨著距離增大重金屬含量降低，表明土壤中這些重金屬可能主要來源于焚燒煙氣的排放沉降。此外，在采樣點(diǎn) E3處存在Cd、Zn、Pb和Cu的高值區(qū)，在采樣點(diǎn)W3處Ni與Pb含量也較高，這可能是因?yàn)樵摬蓸狱c(diǎn)附近主要為建筑工地和道路，受交通運(yùn)輸、建筑施工等污染源影響較大。此外，Cr在采樣點(diǎn)W2處存在一個(gè)高含量區(qū)，經(jīng)實(shí)地考察，該區(qū)域以前是一家機(jī)動(dòng)輪騎車廠，需采用鍍Cr工藝，導(dǎo)致其在周邊土壤中發(fā)生累積。

2.2 硝化-反硝化功能基因豐度分布特征

對所有采樣點(diǎn)土壤中目標(biāo)硝化-反硝化功能基因豐度進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。微生物硝化作用 AOB-amoA基因豐度范圍為 4.89×102～1.34×105copies·g-1，不同土樣之間變化幅度相差較大，達(dá) 3個(gè)數(shù)量級(jí)，而nxrB基因豐度范圍為 5.43×106～5.41×107copies·g-1。反硝化作用功能基因narG、nirS、norB和nosZ豐度范圍分別為 1.21×106～7.91×106copies·g-1、3.79×106～7.39×107copies·g-1、1.61×105～1.33×107copies·g-1和 1.44×104～2.18×105copies·g-1，不同土樣之間變化幅度相差較小，約為1個(gè)數(shù)量級(jí)。土壤氨氧化作用主要由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）承擔(dān)，而在堿性土壤中AOB比AOA更為活躍，是土壤硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)者（Xia et al.，2011），但其受外部環(huán)境因子影響較大。本研究結(jié)果同樣表明，AOB-amoA基因?qū)Νh(huán)境因子的變化較為敏感。

圖2 研究區(qū)域重金屬含量空間分布Fig.2 Spatial distribution of heavy metals in soils in the study area

表3 研究區(qū)各采樣點(diǎn)硝化和反硝化功能基因豐度Table3 Quantities of nitrification and denitrification functional genes of soil samples in the study area

圖3所示為各硝化和反硝化功能基因豐度空間分布情況。分析可知，硝化和反硝化作用功能基因總體變化趨勢基本一致，在焚燒廠附近NW方向豐度較高，SE方向豐度較低。結(jié)合圖2重金屬空間分布情況發(fā)現(xiàn)，硝化和反硝化功能基因豐度較高區(qū)域同樣檢出較高含量重金屬，如采樣點(diǎn)W1（Ni、Zn）、W2（Cr）、NW1（Cd、Zn）、N1（Zn）和NE1（Pb、Zn）等，且總體上隨著重金屬含量的增大，各功能基因豐度呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，表明一定含量范圍的重金屬元素對土壤微生物硝化過程具有促進(jìn)作用。Stuczynski et al.（2003）研究同樣發(fā)現(xiàn)，Cd和Pb通常能夠刺激土壤微生物行為過程，而高含量Zn（＞700 mg·kg-1）對土壤微生物行為具有抑制作用。此外，Broos et al.（2005）研究結(jié)果顯示，重金屬Cd和Zn對土壤硝化速率影響的最低毒性含量分別為 7 mg·kg-1和 107 mg·kg-1，而本研究區(qū)土壤中Cd含量遠(yuǎn)低于7 mg·kg-1，Zn含量除在少部分土樣（33.3%）中超出107 mg·kg 外，其余也均低于該限值，表明重金屬含量對研究區(qū)土壤微生物硝化作用的毒性抑制作用較小。

此外，根據(jù)研究區(qū)采樣點(diǎn)空間分布特征進(jìn)行分析，目標(biāo)硝化-反硝化功能基因在垃圾焚燒廠下風(fēng)向（NW方向）區(qū)域采樣點(diǎn)土壤中的豐度相對較高，而在上風(fēng)向（SE方向）區(qū)域采樣點(diǎn)土壤中相對較低，其分布特征與土壤TN含量分布是一致的，表明垃圾焚燒廠焚燒煙氣污染未對周邊土壤中微生物硝化和反硝化過程產(chǎn)生明顯抑制作用。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示（表4），硝化與反硝化功能基因兩兩之間均呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，除AOB-amoA與nosZ之間相關(guān)性不顯著外（P=0.130），其余硝化與反硝化功能基因之間均具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），表明研究區(qū)土壤中硝化和反硝化作用之間存在一定相關(guān)關(guān)系，并對土壤環(huán)境變化具有一致響應(yīng)性，這與上述硝化和反硝化功能基因空間分布特征是相一致的。此外，Zhou et al.（2012）和高嵩涓等（2017）在稻田土壤中同樣發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。

表4 硝化和反硝化功能基因之間相關(guān)關(guān)系Table4 Correlation between nitrification and denitrification functional genes

2.3 硝化-反硝化功能基因豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析

土壤中硝化和反硝化作用受很多因素影響，如土地利用方式、土壤理化性質(zhì)及外源污染物輸入等（夏月等，2009）。本研究針對目標(biāo)硝化和反硝化功能基因與土壤理化性質(zhì)及重金屬元素進(jìn)行相關(guān)性分析（見表5），結(jié)果表明，除Cd和Zn外，其他5種重金屬與硝化和反硝化功能基因之間均不存在顯著相關(guān)性（P＞0.05），表明重金屬對研究區(qū)土壤硝化和反硝化作用過程影響較小，這可能是因?yàn)檫@些重金屬含量水平較低（見2.1章節(jié)），不足以對土壤硝化和反硝化作用產(chǎn)生顯著的促進(jìn)或抑制作用。相比之下，Cd與amoA、nxrB、narG和norB基因之間，以及Zn與nxrB基因之間均具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），表明Cd和Zn對研究區(qū)土壤硝化和反硝化作用過程具有一定促進(jìn)作用，這與2.2章節(jié)的分析結(jié)果是相一致的。張偉等（2009）研究同樣發(fā)現(xiàn)，低含量Cd（＜1.0 mg·kg-1）能夠促進(jìn)土壤硝化作用，從而造成NO3--N含量相應(yīng)升高，然而隨著 Cd 含量的增大（1.0～70.0 mg·kg-1），土壤硝化作用受到抑制，NO3--N含量則相應(yīng)降低。

圖3 研究區(qū)域功能基因空間分布Fig.3 Spatial distribution of functional genes in soils in the study area

表5 土壤理化性質(zhì)和重金屬含量與硝化和反硝化功能基因之間相關(guān)關(guān)系Table5 Correlation between soil physicochemical properties and heavy metal contents and nitrification-denitrification functional genes

此外，由表5可知，研究區(qū)土壤pH值、TOC和TN與大部分硝化和反硝化功能基因之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），表明土壤理化性質(zhì)是影響硝化和反硝化作用過程的重要因素（Yao et al.，2013；Rosa et al.，2014）。N作為硝化作用的基質(zhì)，對土壤硝化和反硝化過程具有重要影響，相關(guān)性分析結(jié)果同樣表明，土壤TN與目標(biāo)硝化和反硝化功能基因之間均具有顯著相關(guān)性。

土壤 pH值是影響硝化作用的另一個(gè)重要因子，由于pH值會(huì)直接影響氨的存在形態(tài)，且硝化過程需要消耗堿度，因此pH降低會(huì)抑制硝化過程的進(jìn)行。有研究表明（Jiang et al.，2015），在偏堿性（pH=8.2）土壤中硝化作用較為強(qiáng)烈，氨氧化細(xì)菌得到顯著富集。此外，低pH值同樣會(huì)降低反硝化功能酶基因的活性（McMillan et al.，2016），從而不利于反硝化過程的有效進(jìn)行。

C是微生物有機(jī)體的必需組分，由表5可知，土壤TOC與nxrB、narG、nirS和nosZ基因之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），表明土壤有機(jī)質(zhì)含量水平同樣會(huì)影響硝化和反硝化作用過程。Barrett et al.（2016）研究顯示，草地土壤中有機(jī)碳源種類對nirS和nosZ基因具有顯著影響，并能夠改變反硝化作用途徑。

對影響硝化和反硝化功能基因豐度的環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析（RDA），以辨識(shí)影響功能基因豐度的主要環(huán)境因子，如圖4所示。圖中箭頭表示環(huán)境因子，箭頭連線的長度表示環(huán)境因子對功能基因豐度的影響程度，箭頭連線與排序軸間夾角表示該環(huán)境因子與排序軸相關(guān)系數(shù)的大小。Monte Carlo置換檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有排序軸均具有顯著性（P＜0.01），表明排序效果理想。RDA 的前兩軸分別代表了基因豐度51.3%和17.7%的變異，分別對應(yīng)67.4%和23.3%的基因豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。第1排序軸與pH、Pb和Cr相關(guān)性較強(qiáng)，而第2排序軸與TOC、Zn和Cd之間具有顯著相關(guān)性。從圖3可知，土壤TOC、pH和TN是影響硝化和反硝化功能基因豐度的主要影響因子，相比之下，重金屬對其的影響作用較弱，這與上述研究結(jié)果一致。

圖4 冗余度分析環(huán)境因子對土壤硝化和反硝化功能基因豐度的作用影響Fig.4 Redundancy analysis of quantity of nitrification-denitrification functional genes across all of the soil samples

3 結(jié)論

垃圾焚燒廠周邊土壤中共檢出7種重金屬，除As外，其他6種重金屬（Cd、Cr、Cu、Pb、Ni和Zn）均超出上海市土壤背景值，表明周邊土壤已受到不同程度的重金屬污染。目標(biāo)硝化和反硝化功能基因在垃圾焚燒廠周邊土壤中均被檢出，豐度在102～107之間，硝化基因與反硝化基因之間具有顯著相關(guān)性。相關(guān)性分析和冗余分析結(jié)果表明，土壤理化性質(zhì)對硝化和反硝化功能基因豐度變化具有顯著影響，而重金屬對其影響較小。

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