呂帥 王艷林 劉彥廷 蔡宏新 艾文兵

1宜昌市夷陵醫(yī)院（湖北宜昌 443100）；三峽大學(xué) 2醫(yī)學(xué)院，3第一臨床醫(yī)學(xué)院（湖北宜昌 443000）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，存在高復(fù)發(fā)率和高病死率的特點。術(shù)前或術(shù)后化療是治療膠質(zhì)瘤，提高患者生存時間的主要方法之一。然而，化療藥物對膠質(zhì)瘤的治療效果不理想；尤其是經(jīng)過多次化療后，化療藥物治療效果明顯比之前差。而膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥是膠質(zhì)瘤化療效果不理想的主要原因之一。因此，提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性成為提高化療效果的研究熱點。

近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的耐藥性與整合素密切相關(guān)［1-3］。但整合素拮抗劑能否提高化療藥物對耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的治療效果，還需深入的研究。本研究通過整合素αvβ3拮抗劑處理耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，觀察神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡及耐藥蛋白表達(dá)量的變化，探討整合素拮抗劑使耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤對化療藥物的敏感性產(chǎn)生影響及可能的機制，以期為提高化療藥物對耐藥膠質(zhì)瘤的治療效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系：武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心；整合素拮抗劑HYP0023：購于Med?chem Express（MCE）公司；替莫唑胺購于圣克魯斯生物技術(shù)公司；Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于Bender Medsystems公司；DMEM高糖培養(yǎng)液（英杰公司）；MGMT、P?gp、MRP和GST（圣克魯斯生物技術(shù)公司）。

1.2 MTT法檢測U251TR細(xì)胞的培養(yǎng)及HP0023對U251TR的抑制率本研究使用替莫唑胺溶液濃度遞增［4］的方法，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，使其對替莫唑胺產(chǎn)生耐藥，并形成對替莫唑胺具有穩(wěn)定的耐藥性，這樣的耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞株命名為U251TR。誘導(dǎo)的藥物作用濃度梯度為0.25、0.5、1、2、4、16、32 μg/mL。耐藥細(xì)胞U251TR培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)［5］：用MTT法檢測U251和U251TR的IC50和耐藥指數(shù)RF。

用不同濃度的整合素拮抗劑HP0023處理人耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251TR并通過MTT法測得膠質(zhì)瘤細(xì)胞的OD值，計算抑制率。取抑制率小于10%的濃度作為HP0023的后續(xù)試驗濃度。整合素拮抗劑的濃度梯度為：0、0.16、0.32、0.63、1.25、2.5、5、10 μg/mL。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V FITC/PI雙染法測細(xì)胞的凋亡將U251TR分為4組，根據(jù)MTT法實驗結(jié)果，分別采用對照試劑、HYPOO23（0.16 μg/mL）、替莫唑胺（32 μg/mL）和 HYPOO23（0.16 μg/mL）+替莫唑胺（32 μg/mL）處理48 h后。按Annexin V FITC/PI雙染法，將細(xì)胞用Annexin V?FITC、碘化丙啶染色液，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，每組測3個樣本。

1.4 Westen blot方法檢測MGMT、P?gp、MRP和GST蛋白取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1.25×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，將耐藥細(xì)胞U251TR分為4組，24 h后，分別采用對照試劑、拮抗劑、替莫唑胺和拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺處理。48 h后，收集所有細(xì)胞，根據(jù)Western blot方法檢測不同的處理方式對U251TR細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析。計量資料用表示，采用單因數(shù)方差分析進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功培養(yǎng)耐藥膠質(zhì)瘤U251TR細(xì)胞本研究使用替莫唑胺溶液濃度遞增的方法，經(jīng)過10個月培養(yǎng)得到耐藥細(xì)胞U251TR。U251TR/U251的耐藥指數(shù)RF=8.03±0.46。U251細(xì)胞和U251TR細(xì)胞的IC50為（4.55± 2.21）μg/mL和（36.54± 5.01）μg/mL，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明成功構(gòu)建了耐藥細(xì)胞U251TR。且以32 μg/mL替莫唑胺作為試驗濃度，用不同濃度的HP0023處理人耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87TR，通過MTT法測得HP0023濃度為0.16 μg/mL時抑制率為（8.11±2.23）%，以該濃度作為試驗濃度。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V FITC/PI雙染法測細(xì)胞的凋亡對照試劑早期凋亡率為（1.8±0.9）%，晚期凋亡率為（3.4±0.8）%；拮抗劑早期凋亡率為（3.8±1.0）%，晚期凋亡率為（3.1±0.9）%；替莫唑胺早期凋亡率為（2.6±1.0）%，晚期凋亡率為（2.2±0.7）%；拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺處理早期凋亡率為（10±1.2）%，晚期凋亡率為（8.5±0.9）%。拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺處理組與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V FITC/PI雙染法測各組U251TR細(xì)胞凋亡Fig.1 Flow cytometry Annexin V FITC/PI double staining test groups U251TR cell apoptosis

2.3 Western blot檢測耐藥蛋白表達(dá)水平4個實驗組 Western blot檢測細(xì)胞 MGMT、P?gp、MRP 和GST蛋白表達(dá)（圖2）顯示，與對照組和替莫唑胺組相比，HYPOO23組和HYPOO23+替莫唑胺組的MGMT和P?gp蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MRP和GST蛋白表達(dá)水平未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 不同處理方式對MGMT、P?gp、MRP和GST蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 The impact of MGMT，P?gp，MRP and GST protein expression level by different processing methods

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞耐藥與P?糖蛋白（P?gly?eoprote，P?gp）［5-6］、多藥耐藥相關(guān)蛋（multi?drug re?sistance related protein，MRP）［7］、O6 甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6?methyl?guanine?DNA ?methyl?transferase［8］，MGMT）、谷胱甘肽/谷胱甘肽?S轉(zhuǎn)移酶（GSH/GSTS）［9］等多種耐藥機制有關(guān)。然而，近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的耐藥性與整合素密切相關(guān)［1-3］。但整合素拮抗劑與耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的治療效果相關(guān)關(guān)系還需深入的研究。

整合素是存在于細(xì)胞膜表面，由α亞基和β亞基構(gòu)成的二聚體，含有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜α螺旋和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［10-11］。在課題組前期的研究［12-13］中發(fā)現(xiàn)，其參與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為，如腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等。本研究通過整合素αvβ3拮抗劑HYP0023與替莫唑胺分別或聯(lián)合處理耐藥的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，觀察神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示經(jīng)HYP0023聯(lián)合替莫唑胺處理的耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率比其他3組高；證實阻滯整合素向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號，可提耐藥膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，且HYP0023可以提高化療藥的治療效果。這與HSIEH等［14］阻滯整合素向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號，提高急性淋巴細(xì)胞白血病的腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性［13］的實驗結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果還顯示，拮抗劑HYPOO23組和HYPOO23+替莫唑胺組的MGMT和P?gp蛋白表達(dá)水平降低，而MRP和GST蛋白蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。GAO等［15］發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR?370?3p影響MGMT表達(dá)量，可以提高多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的替莫唑胺化療敏感性。因此，有理由相信，MGMT和P?gp蛋白參與整合素拮抗劑提高耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性和促進(jìn)凋亡的現(xiàn)象。類似的實驗結(jié)果還未見相關(guān)的報道，且具體的作用機制及信號傳導(dǎo)途徑有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，整合素拮抗劑HYP0023可以調(diào)節(jié)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性，促進(jìn)凋亡；并且這現(xiàn)象與MGMT和P?gp表達(dá)下降有關(guān)。但這個現(xiàn)象，還需進(jìn)一步的動物實驗來驗證。本課題也為臨床克服膠質(zhì)瘤患者化療耐藥提供了一個新思路。

［1］KANNAN N，NGUYEN L，EAVES C.Integrin β3 links thera?py resistance and cancer stem cell properties［J］.Nat Cell Bi?ol，2014，16（5）：397?399.

［2］KWAKWA K A，STERLING J A.Integrin αvβ3 Signaling in Tumor?Induced Bone Disease［J］.Cancers，2017，9（7）：84.

［3］MONTENEGRO C F，CASALI B C，LINO R L B，et al.Inhibi?tion of αvβ3 integrin induces loss of cell directionality of oral squamous carcinoma cells（OSCC）［J］.PLoS One，2017，12（4）：e0176226.

［4］陳曉，涂漢軍，郭偉，等.膠質(zhì)瘤多藥耐藥細(xì)胞株U251/TMZ的生物學(xué)特性［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2014，19（2）：91?94.

［5］LONG Q Z，ZHOU M，LIU X G，et al.Interaction of CCN1 with alphavbeta3 integrin induces P?glycoprotein and confers vinblastine resistance in renal cell carcinoma cells［J］.Antican?cer Drugs，2013，24（8）：810?817.

［6］TUGUNTAEV R G，CHEN S，ELTAHAN A S，et al.P?gp In?hibition and Mitochondrial Impairment by Dual?Functional Nanostructure Based on Vitamin E Derivatives To Overcome Multidrug Resistance［J］.ACS Appl Mater Interfaces ，2017，9（20）：16900?16912.

［7］GORDILLO G M，BISWAS A，KHANNA S，et al.Multidrug resistance?associated protein?1（MRP?1）?dependent glutathione disulfide（GSSG）efflux as a critical survival factor for oxidant?enriched tumorigenic endothelial cells［J］.J Biol Chem，2016，291（27）：14394.

［8］ZHU Z，DU S，DING F，et al.Ursolic acid attenuates temo?zolomide resistance in glioblastoma cells by downregulating O6?methylguanine?DNA methyltransferase（MGMT） expression［J］.Am J Transl Res，2016，8（7）：3299?3308.

［9］HAN B，WANG Y，WANG L，et al.Preparation of GST in?hibitor nanoparticle drug delivery system and its reversal effect on the multidrug resistance in oral carcinoma［J］.Nanomateri?als，2015，5（4）：1571?1587.

［10］KLAPHOLZ B，BROWN N H.Talin?the master of integrin ad?hesions［J］.J Cell Sci，2017，130（15）：2435?2446.

［11］TOLOMELLI A，GALLETTI P，BAIULA M，et al.Can Integ?rin Agonists Have Cards to Play against Cancer？A literature survey of small molecules integrin activators［J］.Cancers，2017，9（7）：78.

［12］肖寧，艾文兵，劉彥廷，等.整合素拮抗劑IS201對GL15膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，28：58?59.

［13］呂帥，王艷林，艾文兵.整合素與腫瘤細(xì)胞耐藥［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（15）：2578?2580.

［14］HSIEH Y T，GANG E J，GENG H，et al.Integrin alpha4 blockade sensitizes drug resistant pre?B acute lymphoblastic leu?kemia to chemotherapy［J］.Blood，2013，121（10）：1814?1818.

［15］GAO Y，CHEN X，LIU H.Up?regulation of miR?370?3p re?stores glioblastoma multiforme sensitivity to temozolomide by in?fluencing MGMT expression［J］.Sci Rep，2016，6：32972.