張明謙 李艷 畢瑜 羅文娟 韓飛

1昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科（昆明 650051）；2中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所（重慶 400038）

現(xiàn)今世界范圍內(nèi)肺癌已成為腫瘤性疾病中排名第一的惡性腫瘤［1-2］，因其預(yù)后差及病死率高，已嚴(yán)重威脅人類健康。目前，超過(guò)60%的新診斷肺癌患者被確定為臨床晚期患者。大多數(shù)晚期肺癌患者已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，從而失去手術(shù)根除治療的可行性，這也是肺癌死亡率極高的最主要原因。因此，尋找有效的早期診斷和靶向治療方法是降低肺癌死亡率的重要手段。

肺癌形成是一個(gè)遺傳和表觀遺傳異常積累的多步驟過(guò)程。眾多研究［3-5］已證實(shí)DNA甲基化作為表觀遺傳的最主要形式之一廣泛參與了腫瘤的形成過(guò)程，其主要原因是DNA高甲基化常常致使重要腫瘤抑癌基因表達(dá)失活。因此，篩選和鑒定新的功能性甲基化調(diào)控基因?qū)θ骊U明肺癌發(fā)生的分子機(jī)制和尋找更好的肺癌診斷及治療靶點(diǎn)并最終有效防控肺癌具有重要意義。

人類 LHX6（LIM homeobox domain 6）基因定位于第9號(hào)染色體的q33.2位置，是編碼LIM同源域的轉(zhuǎn)錄因子之一，參與胚胎發(fā)育過(guò)程和影響多器官系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生［6-7］。在腫瘤方面有研究［8-9］認(rèn)為L(zhǎng)HX6基因甲基化可以作為一個(gè)識(shí)別頭頸癌的甲基化標(biāo)記物，而在宮頸癌中則可能具有重要的早期診斷價(jià)值。近期課題組發(fā)現(xiàn)LHX6基因在肺癌中呈現(xiàn)了高甲基化，但LHX6基因在肺癌中甲基化程度與其表達(dá)之間關(guān)系以及該基因在肺癌中的生物學(xué)功能目前還不清楚，因此，本研究采用甲基化特異性PCR（methylmion Specific PCR MSP）并結(jié)合RT?PCR和qPCR方法檢測(cè)了肺癌組織和癌旁組織、正常肺組織、肺癌細(xì)胞系中LHX6基因的甲基化水平及該基因表達(dá)水平。同時(shí)通過(guò)過(guò)表達(dá)LHX6基因后對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖影響進(jìn)行觀察，初步獲取該基因在肺癌中的生物學(xué)功能，為深入研究LHX6基因在疾病發(fā)生、信號(hào)通路等方面提供資料。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本和細(xì)胞來(lái)源本實(shí)驗(yàn)臨床標(biāo)本來(lái)自于2016年1月至2017年10月昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院胸外科手術(shù)切除肺癌患者腫瘤標(biāo)本及中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)毒理研究所標(biāo)本庫(kù)，配對(duì)癌旁組織均距離腫瘤邊緣＞2 cm，標(biāo)本離體后按標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本處置流程制作成石蠟包埋蠟塊。入選標(biāo)本患者均未接受化療及放療治療。研究通過(guò)昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，招募患者均簽署了知情同意書(shū)。

實(shí)驗(yàn)所用肺癌細(xì)胞系均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院資源中心，肺癌細(xì)胞系保存和制備均符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2 方法

1.2.1 MSP檢測(cè)石蠟包埋組織通過(guò)二甲苯脫蠟處理獲取組織，肺癌細(xì)胞系按要求進(jìn)行培養(yǎng)并消化收集所需細(xì)胞，通過(guò)DNA提取試劑盒對(duì)組織和細(xì)胞DNA進(jìn)行提取，瓊脂凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。DNA methylation?gold kit試劑對(duì)產(chǎn)物修飾處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物如表1。

1.2.2 RT?PCR與qPCR腫瘤組織通過(guò)經(jīng)典Trizol法提取總RNA，測(cè)定OD260/OD280值，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后儲(chǔ)存在-20℃冰箱待用。RT?PCR產(chǎn)物使用2.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，qPCR使用熒光定量?jī)x器進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分析使用2?ΔΔCT法計(jì)算。引物如表2。

表1 甲基化特異性PCR（MSP）引物設(shè)計(jì)Tab.1 Design of primers for methylation specific PCR（MSP）

表2 實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)（qPCR）引物設(shè)計(jì)Tab.2 Design of primers for Real?time Quantitative PCR

1.2.3 免疫組化Anti?LHX6購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司（ab57064）。按實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行稀釋，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性率的乘積進(jìn)行表達(dá)水平定量，具體如下：按染色陽(yáng)性率及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，其中染色陽(yáng)性率分值4分（≤ 5%，0分；5% ～25%，1分；26% ～50%，2分；51% ～75% ，3分；＞76% ，4分），染色強(qiáng)度分值3分（陰性，0分；弱陽(yáng)性，1分；中陽(yáng)性，2分；強(qiáng)陽(yáng)性，3分）。根據(jù)平均表達(dá)值對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行劃分，0～7分為低表達(dá)組；8～12分為高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：（1）配對(duì)t檢驗(yàn)；（2）χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LHX6基因在肺癌組織中及肺癌細(xì)胞系中的甲基化情況通過(guò)MSP對(duì)入選患者肺癌組織及實(shí)驗(yàn)所用肺癌細(xì)胞系LHX6基因甲基化分析發(fā)現(xiàn)，正常組織和癌旁組織與肺癌組織相比較，LHX6基因在肺癌組織中出現(xiàn)了明顯甲基化情況P＜0.05；在肺癌細(xì)胞系中也出現(xiàn)了不同程度的甲基化情況，而正常支氣管粘膜細(xì)胞該基因未發(fā)生甲基化，兩者具有顯著差異P＜0.05（圖1）。

2.2 LHX6基因在肺癌組織中及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組化我們對(duì)LHX6基因在肺癌組織，癌旁組織LHX6基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比較，LHX6基因在癌組織中出現(xiàn)了低表達(dá)情況（圖2），進(jìn)一步通過(guò)RT?PCR與qPCR對(duì)LHX6基因在肺癌組織、癌旁組織及肺癌細(xì)胞系表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在癌組織中呈現(xiàn)了明顯表達(dá)下降趨勢(shì)，肺癌細(xì)胞系與正常支氣管黏膜細(xì)胞HBE相比較LHX6基因表達(dá)也呈現(xiàn)明顯低表達(dá)情況（圖3）。

圖1 LHX6基因在正常組織、肺癌組織及肺癌細(xì)胞株中甲基化檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Representative results of LHX6 methylation status were shown in human tissue and cell lines

圖2 LHX6基因表達(dá)水平在正常癌旁組織及肺癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig.2 LHX6 expression was tested in tumor and adjacent lung tissues of patients using IHC

Fig.3 The mRNA expression of LHX6 was analyzed in lung tissues and cell lines by RT?PCR and qPCR圖3 LHX6基因在肺癌組織及肺癌細(xì)胞株中mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

2.3 LHX6基因甲基化與其表達(dá)的關(guān)系為了驗(yàn)證LHX6基因甲基化水平是否調(diào)控該基因表達(dá)，筆者在肺癌細(xì)胞系中進(jìn)行了去甲基化藥物5?雜氮-2-脫氧胞苷（5?aza?dC）處理，并對(duì)比處理前后腫瘤細(xì)胞中LHX6基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)去甲基化處理后，LHX6基因在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)了表達(dá)升高的情況（圖4），說(shuō)明該基因表達(dá)受甲基化調(diào)控，甲基化程度與該基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4 5?雜氮?2?脫氧胞苷去甲基化處理后LHX6基因mRNA在肺癌細(xì)胞株表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The mRNA expression of LHX6 was restored in lung cancer cell lines after treatment with the demethylation agent 5?aza?dC

2.4 LHX6表達(dá)與肺癌患者臨床特征關(guān)系分析對(duì)入組88名肺癌患者臨床特征進(jìn)行分析，研究對(duì)象年齡，性別，臨床分期均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，但該基因高表達(dá)組在組織學(xué)特征和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織大小與低表達(dá)相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3），提示該基因表達(dá)與肺癌患者的腫瘤細(xì)胞惡性程度及腫瘤大小相關(guān)，與早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有一定關(guān)系。LHX6高表達(dá)后可以減輕腫瘤細(xì)胞惡性程度及腫瘤大小，且可以減少早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性。

2.5 LHX6基因在肺癌中的生物學(xué)功能初步研究為了初步探索LHX6基因在肺癌中的生物學(xué)功能，我們?cè)诜伟┘?xì)胞系中對(duì)LHX6基因過(guò)表達(dá)處理，并通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)該基因過(guò)表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LHX6基因過(guò)表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖明顯受到抑制（圖5），該基因具有明顯的抑癌作用。

3 討論

目前眾多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在導(dǎo)致腫瘤性疾病發(fā)生多種原因中，表觀遺傳調(diào)控異常起著重要作用，其中以DNA甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默最終形成腫瘤的觀點(diǎn)被廣為接受［10-11］。因此深入開(kāi)展因DNA甲基化引起的表觀遺傳變化對(duì)于有效控制腫瘤性疾病的發(fā)生具有重大的意義。

表3 88例肺癌患者LHX6表達(dá)水平與臨床特征情況Tab.3 Correlations between LHX6 expression and clinical parameters in 88 lung adenocarcinoma patients 例

圖5 LHX6基因抑制腫瘤細(xì)胞增殖（細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)）Fig.5 LHX6 inhibits cancer cell growth by cck8 and Colony formation assays

LHX6基因作為編碼LIM同源域的轉(zhuǎn)錄因子，在其啟動(dòng)子區(qū)域具有一個(gè)典型的CpG島［12-13］。已有研究證實(shí)，該基因與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，如頭頸部腫瘤等［9］。而LHX6基因在肺癌中是否也存在DNA甲基化異常目前報(bào)道尚少，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)該基因在肺癌組織、癌旁組織及肺癌細(xì)胞系中甲基化情況進(jìn)行檢查，分析該基因甲基化與其表達(dá)的相關(guān)性，并初步探索該基因在肺癌中所發(fā)揮的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步深入研究LHX6基因提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比較LHX6基因在肺癌組織中呈現(xiàn)明顯的高甲基化情況，同時(shí)相應(yīng)的肺癌細(xì)胞系中（A549、95D、H358、H460、SPC?A?1）與正常支氣管黏膜細(xì)胞（HBE）相比較，LHX6基因也呈現(xiàn)了不同程度的甲基化情況。筆者對(duì)肺癌組織、癌旁正常組織及肺癌細(xì)胞系中該基因的表達(dá)進(jìn)行了進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LHX6基因在肺癌組織中和肺癌細(xì)胞系中均出現(xiàn)了表達(dá)下降情況。為了明確該基因甲基化是否調(diào)控其表達(dá)，我們?cè)诜伟┘?xì)胞系中應(yīng)用5?雜氮?2?脫氧胞苷（5?aza?dC）進(jìn)行了去甲基化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)去甲基化處理后，該基因表達(dá)上調(diào)。因此，筆者認(rèn)為L(zhǎng)HX6基因在肺癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)生了由異常甲基化導(dǎo)致的異常情況表達(dá)，暗示LHX6可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。

為了初步探索LHX6基因肺癌發(fā)生、發(fā)展中可能的功能，筆者構(gòu)建該基因表達(dá)載體，并對(duì)LHX6基因低表達(dá)或不表達(dá)肺癌細(xì)胞系進(jìn)行過(guò)表達(dá)處理，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8法）及克隆形成實(shí)驗(yàn)分析該基因過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)LHX6基因后，腫瘤細(xì)胞增殖和克隆形成明顯受到抑制。這些功能性數(shù)據(jù)表明，LHX6基因在肺癌中是一個(gè)重要的抑癌因子。不過(guò)，筆者對(duì)LHX6基因功能的研究?jī)H處于探索階段，目前該基因?qū)δ[瘤細(xì)胞周期、凋亡、遷移和侵襲的影響還不清楚，而且LHX6基因發(fā)揮抑癌功能的具體信號(hào)通路研究也尚未開(kāi)展，將在今后的工作中逐步深入研究。值得一提的是，筆者的最新數(shù)據(jù)顯示LHX6的抑癌作用可能與Wnt/β?catenin信號(hào)通路有關(guān)［14-15］。

本研究的主要不足之處是肺癌樣本量較小，不能進(jìn)行更有意義的臨床分析如該基因與病人預(yù)后的關(guān)系等。在接下來(lái)的研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，收集更詳盡臨床信息包括患者生存時(shí)間、放療和化療情況等，為分析和確定該基因能否可以應(yīng)用于臨床防治奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，LHX6基因在肺癌及肺癌細(xì)胞系中表現(xiàn)為高甲基化情況，且其甲基化程度調(diào)控該基因表達(dá)，過(guò)表達(dá)該基因后可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，因此筆者認(rèn)為L(zhǎng)HX6基因在肺癌中是一個(gè)重要的抑癌基因，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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