蓋領(lǐng) 茅國新 吳錦偉 呂麗婷 姚寧華 陳潔

1南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤化療科（江蘇南通 226001）；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院（江蘇南通 226001）；3南通大學(xué)附屬醫(yī)院放療科（江蘇南通 226001）；4江陰市人民醫(yī)院腫瘤科（江蘇江陰 214400）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，主要病理類型包括非小細(xì)胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small?cell lung cancer，SCLC）兩大類，其中NSCLC占80%左右。由于接近75%的肺癌患者在疾病診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期或伴有轉(zhuǎn)移，因此對于這部分患者化療是主要的有利治療手段。盡管近年來肺癌化療取得了長足的進(jìn)步，但其5年生存率僅為15%［1-2］。分子伴侶家族是一類在細(xì)胞內(nèi)能夠協(xié)助其他多肽進(jìn)行折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解的蛋白，并在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架功能、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的生理作用［3］。CCT屬于Ⅱ型伴侶素，是目前真核細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯一伴侶素，CCT8（chaper?onin containing TCP1，subunit 8）是CCT家族中的一個(gè)分子亞型。越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道CCT8在腸癌、膠質(zhì)瘤和原發(fā)性肝癌中異常表達(dá)［4-5］，但在肺癌中尚未見報(bào)道。本研究通過免疫組化及蛋白免疫印跡法檢測NSCLC組織中CCT8的表達(dá)，并分析其與NSCLC臨床病理學(xué)特征以及預(yù)后的關(guān)系，研究CCT8對NSCLC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的影響，以期能為NSCLC提供新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本NSCLC石蠟標(biāo)本140例，由南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。標(biāo)本均為2005-2009年手術(shù)切除標(biāo)本，病理診斷明確，并且有完整的臨床病理學(xué)隨訪資料?；颊吣挲g介于44～83歲；腫瘤直徑≤3 cm者48例，腫瘤直徑＞3 cm者92例；組織學(xué)分型：鱗癌91例，腺癌37例，鱗腺癌12例；組織學(xué)分級(jí)：1級(jí)13例，2級(jí)69例，3級(jí)58例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例，無轉(zhuǎn)移者80例。

1.2 蛋白電泳法收集NSCLC組織和癌旁組織，提取蛋白進(jìn)行SDS?PAGE電泳，分別加入兔抗人CCT8多克隆抗體（1∶1 000，Santa cruz公司），GAP?DH兔抗人多克隆抗體（1∶1 000，Santa cruz公司）；NBT/BCIP顯色，自動(dòng)凝膠分析儀照相，分析NSCLC組織和癌旁組織中CCT8、Ki?67和GAPDH蛋白的表達(dá)。

1.3 免疫組化染色石蠟包埋組織60℃（于電熱恒溫干燥箱內(nèi)，下同）烤片6～8 h。二甲苯15 min×3次（60℃）后用低濃度梯度的乙醇水化，自來水沖洗片刻。利用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（PH 6.0）及高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后用3%H2O2孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次。滴加一抗，兔抗人CCT8多克隆抗體（1∶1 000），鼠抗Ki?67（1∶500），室溫孵育2 h。使用PBS作為陰性對照。0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次，擦干后滴加組化二抗，室溫孵育。0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，高濃度梯度的乙醇脫水，中性樹脂封片。

1.4 陽性結(jié)果判斷采用雙盲法光鏡下觀察結(jié)果。每片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×200倍）。CCT8蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞漿，結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：按腫瘤陽性細(xì)胞率和著色強(qiáng)度分別進(jìn)行計(jì)分：（1）按陽性細(xì)胞百分率：0分（陰性）、1分（10%以下）、2分（10～50%）和3分（50%以上）。（2）按著色計(jì)分：分為4個(gè)等級(jí)，0分（陰性）、1分（淡棕色）、2分（棕色）和3分（深棕色）。2種記分的乘積為檢測的表達(dá)狀況，總分＜3分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。Ki?67蛋白表達(dá)以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性，Ki?67胞核染色按腫瘤陽性細(xì)胞率20%分為：≤ 20%為低表達(dá)，＞ 20%為高表達(dá)［6］；所有切片均由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家單獨(dú)閱片。

1.5 隨訪本組全部140例NSCLC患者均從病理確診時(shí)開始計(jì)算生存時(shí)間，以電話形式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)限為5年，隨訪率100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。對CCT8和K?i67蛋白在NSCLC中的表達(dá)與相應(yīng)的臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan?Meier生存曲線和 log?rank檢驗(yàn)分析生存數(shù)據(jù)，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，并記錄每個(gè)數(shù)據(jù)的危險(xiǎn)比和95%可信區(qū)間。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCT8蛋白在NSCLC組織和癌旁組織中表達(dá)蛋白印跡結(jié)果顯示：在NSCLC組織中，CCT8呈高表達(dá)，在癌旁組織中表達(dá)相對較低（圖1）。

圖1 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測3對NSCLC組織中CCT8的表達(dá)Fig.1 The expression of CCT8 in 3 paired NSCLC tissues by Western blot

2.2 NSCLC石蠟切片組織中CCT8的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示CCT8在人NSCLC組織中高表達(dá)，表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，染色呈棕褐色。Ki?67在NSCLC中高表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞核中，染色呈棕黃或棕褐色（圖2）。

2.3 CCT8的表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系根據(jù)CCT8在NSCLC組織中的表達(dá)水平，將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析CCT8的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。結(jié)果顯示CCT8的表達(dá)強(qiáng)度與NSCLC患者組織學(xué)分級(jí)（P=0.001）、臨床分期（P=0.015）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）和Ki?67（P=0.0014）有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與患者的年齡、性別、吸煙、組織學(xué)分型及腫瘤大小無關(guān)（表1）。

2.4 CCT8蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系根據(jù)COX回歸分析顯示，CCT8（P=0.013）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）和Ki?67（P=0.012）均與預(yù)后相關(guān)（表2）。經(jīng)Kaplan?Meier分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者中CCT8的低表達(dá)和高表達(dá)者的中位生存期分別為41個(gè)月和27個(gè)月，結(jié)果顯示：CCT8高表達(dá)患者預(yù)后較差（P＜0.05），提示NSCLC患者中CCT8的表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)（圖3）。

3 討論

圖2 免疫組化方法檢測CCT8、Ki?67蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)（×200）Fig.2 Expression of CCT8 and Ki?67 in NSCLC by immunohistochemistry（× 200）

表1 CCT8蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between CCT8 expression and the clinicopathologic factors 例

表2 臨床特征與NSCLC預(yù)后的關(guān)系Tab.2 The relationship between the clinical parameters and the prognosis in NSCLC

圖3 CCT8表達(dá)的生存曲線Fig.3 Correlation between patients′survival and the expression of CCT8

肺癌是全球發(fā)病率最高的腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。由于起病隱匿，大部分肺癌患者確診時(shí)已到晚期，5年生存率低［7］。眾多通路參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，如 TGF?β/Smad4信號(hào)通路，Wnt/β?catenin信號(hào)通路［8］，表皮生長因子受體（EGFR）信號(hào)通路等［9］。細(xì)胞周期的失調(diào)可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。癌基因的過表達(dá)與抑癌基因的缺失可導(dǎo)致腫瘤形成。許多癌基因參與腫瘤的形成，如EGFR，Ras基因［10］等。評(píng)估NSCLC預(yù)后的最重要指標(biāo)包括原發(fā)腫瘤的大小，區(qū)域淋巴結(jié)受累，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。尋找病理組織學(xué)和生化標(biāo)記物對于判斷侵襲性NSCLC的不良預(yù)后及治療反應(yīng)起著尤為關(guān)鍵的作用。雖然隨著治療方法的不斷進(jìn)步，NSCLC患者的生存率和生活質(zhì)量逐漸提高，但是尋找新穎的判斷預(yù)后的指標(biāo)具有重要的治療意義［11］。

伴侶素（Hsp60）家族廣泛存在于生物界，Arch分型將伴侶素（Hsp60）分為Ⅰ型和Ⅱ型兩型，其中CCT屬于Ⅱ型伴侶素，是目前真核細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯一伴侶素。CCT有8個(gè)不同的亞型，即CCTα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ。不同亞型的結(jié)構(gòu)和成分還是有較大的異源性。CCT可以確保一些參與細(xì)胞生長和生存的蛋白正確折疊，包括微管蛋白、肌動(dòng)蛋白、POLO樣激酶1（Plk I）和細(xì)胞周期素E等。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，隨著CCT亞型轉(zhuǎn)錄，處于G1/S期的細(xì)胞明顯向S期轉(zhuǎn)化，從而推動(dòng)細(xì)胞周期 的 進(jìn) 展 。 CCT8（Chaperonin containing TCP1，subunit 8）是CCT家族中的一個(gè)分子亞型，越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道CCT8在腸癌、膠質(zhì)瘤和原發(fā)性肝癌中異常表達(dá)。

鑒于CCT8在細(xì)胞增殖中的重要性，研究其在NSCLC中的發(fā)生發(fā)展具有非常重要的意義。本文通過免疫組化發(fā)現(xiàn)CCT8在人NSCLC中高表達(dá)，并主要定位于細(xì)胞漿（圖2），其趨勢與細(xì)胞周期中重要的調(diào)節(jié)因子Ki?67一致。本研究結(jié)果顯示NSCLC中CCT8的表達(dá)與患者組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、Ki?67表達(dá)水平有關(guān)（表1），進(jìn)行K?M曲線（圖3）分析提示：NSCLC患者中CCT8的低表達(dá)水平者的中位生存期為41個(gè)月，較CCT8高表達(dá)的NSCLC患者的中位生存期（27個(gè)月）延長了14個(gè)月，提示CCT8高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后較差。通過Cox回歸分析表明，CCT8、淋巴結(jié)和Ki?67均可作為NSCLC預(yù)后的判斷指標(biāo)（表2）。本次研究存在以下不足：樣本量不夠大，無法分別分析CCT8在鱗癌和腺癌中的預(yù)后判斷價(jià)值，隨訪時(shí)間不夠長。以后的研究中，筆者將進(jìn)一步分析CCT8在NSCLC中的分子功能及具體機(jī)制。

本研究結(jié)果表明CCT8在NSCLC組織中高表達(dá)，并與NSCLC的不良預(yù)后密切相關(guān)；CCT8可能促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展。這為NSCLC的預(yù)后判斷提供了新的依據(jù)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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