黃潔 李承紅 陳實 鐘金男 劉敏 李發(fā)久

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院（武漢市第六醫(yī)院）呼吸內(nèi)科（武漢 430016）

現(xiàn)代實驗研究證實“國飲”綠茶具有抗衰老、抗氧化、降脂和抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤細胞遷移的作用［1-3］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epi?gallocatechin gallate，EGCG）是其藥理學(xué)作用的主要活性成分［4］。最新研究［5-7］發(fā)現(xiàn)，EGCG 具有抗氧化、抗病毒和促進腫瘤細胞凋亡的作用。近年發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號通路參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)，該信號通路對細胞的生長、遷移、增殖和分化［8］。順鉑（Cisplatin）作為一種化療藥物，廣泛的應(yīng)用于包括肺癌在內(nèi)的多種實體瘤的治療［9］，研究［10-11］證實，在眾多包括肺癌在內(nèi)的眾多實體瘤中存在高表達EGFR，且與順鉑對腫瘤的敏感性聯(lián)系甚密，其可能是順鉑用于治療晚期非小細胞肺癌等癌癥的重要作用機制之一。然而，其并未取得滿意的安全性和有效性。有研究［12-13］顯示，EGCG在動物模型中顯示出無毒性作用、抗突變和抗腫瘤的特性。EGCG可作為腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，能夠改善癌細胞對化療的敏感性并減輕毒性作用，所以更多的臨床研究更青睞于將EGCG與化療、放療等其他醫(yī)療手段并用來治療癌癥，具有廣泛的抗非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）治療前景［14］。目前已經(jīng)有許多關(guān)于以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案的系統(tǒng)評價，但尚未有EGCG與順鉑聯(lián)合方案應(yīng)用于NSCLC的體外實驗研究和具體作用機制的研究的報道。本研究擬在NSCLC體外癌細胞上探究EGCG和順鉑聯(lián)合使用對NSCLC細胞的增殖和凋亡的分子機制，為EGCG用于臨床NSCLC治療和耐藥性改善提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑EGCG（規(guī)格10 mg，純度≥97%，貨號93894，Sigma），順鉑（規(guī)格 25 mg，純度≥ 97%，貨號P4394，Sigma）、人肺腺癌NCI?H1975細胞和人肺鱗狀上皮癌NCI?H520細胞系由武漢大學(xué)生命科學(xué)院細胞庫提供。Cell Counting Kit?8（CCK?8）試劑盒（碧云天生物有限公司），抗磷酸化EGFR（phospho?EGFR）和 EGFR 多克隆抗體（Protein?tech）。EGFR、β?actin引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 主要儀器電泳儀（美國Bio?Rad）；RT?qPCR反應(yīng)儀（美國Bio?Rad）；熒光倒置顯微鏡（日本Olymics）。

1.3 細胞及其培養(yǎng)NCI?H520和NCI?H1975細胞株在37 ℃、5%CO2條件下，于10%FBS的RPMI?1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。

1.4 EGCG和順鉑不同時間及濃度對細胞生長的影響取對數(shù)生長期的細胞，按照每孔2×103個/孔接種96孔板中，培養(yǎng)6 h貼壁。依次更換含0，20，40，80，160和320 μmol/L的EGCG，0，0.25，0.5，1，2，4和8 μg/mL的順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)24，48和72 h。每孔加入 CCK?8溶液 10 μL，培養(yǎng)4 h后于450 nm處測定吸光度（OD）。抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/OD對照組×100%。

1.5 EGCG和順鉑合用對NCI?H520和NCI?H1975細胞凋亡的影響按照細胞數(shù)每孔1×105個/孔接種6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6 h后，更換為3 mL含2%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h進行細胞同步化；設(shè)置空白組、EGCG、順鉑和EGCG+順鉑組；依照Hoechst 33258染色操作，觀察細胞核變化。

1.6 EGCG對NCI?H520和NCI?H1975細胞中Pt和Pt?DNA結(jié)合物含量的影響采用Tris平衡酚法抽提DNA，并調(diào)節(jié)DNA濃度至100 ng/L后用5%硝酸處理后，用電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測。

1.7 EGCG和順鉑合用對NCI?H520和NCI?H1975細胞Phospho?EGFR和EGFR表達的影響提取細胞總蛋白并BCA法檢測蛋白濃度。干熱變性后，40 μg總蛋白用于Western blot。根據(jù)Image J2X計算的各條帶灰度的變化，檢測EGCG和順鉑合用對細胞Phospho?EGFR和EGFR蛋白表達影響。

1.8 EGCG和順鉑合用對NCI?H520和NCI?H1975細胞EGFR mRNA表達的影響Trizol提取細胞總RNA，RT?PCR逆轉(zhuǎn)錄后取25 ng cDNA作為反應(yīng)模版，20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，擴增40個循環(huán)，擴增結(jié)束后制作融解曲線，以β?actin為內(nèi)參，采用 2?△△Ct法計算 EGFR mRNA 的相對表達量。產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。EGFR（177 bp）引物序列為 5′?AGGCAC?GAGT?AACAAGCTCAC?3′和 5′?ATGAGGACATA?ACCAGCCACC?3′。β?actin（250 bp）引物序列為5′?CATGT?ACGTTGCTATCCAGGC?3′和 5′?CTCCTTA?ATGTCA?CGCACGAT?3′。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以表示，兩個樣本均數(shù)用t檢驗，多個樣本間采用完全隨機的單因素方差分析，檢驗水平α為0.05，以P＜0.05作為具有顯著差異的檢驗標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 不同濃度和作用時間EGCG及順鉑對NCI?H520和NCI?H1975細胞增殖的影響如圖1所示，EGCG與順鉑的抑制作用隨時間和濃度增加而增強（P＜0.05）。24 h抑制作用最好，分別為：EGCG的濃度為20 μmol/L，順鉑的濃度為4 μg/mL。

圖1 不同濃度及作用時間EGCG和順鉑對NCI?H520、NCI?H1975細胞增殖的抑制作用Fig.1 EGCG and Cisplatin inhibit the proliferation of NCI?H520和NCI?H1975 cells at different concentrations and times

2.2 EGCG增強順鉑對NCI?H520和NCI?H1975細胞的抑制作用如圖2所示，EGCG與不同濃度的順鉑合用24 h后，相比于順鉑單獨作用，抑制率顯著增高（P＜0.05），且隨順鉑濃度增加而增強（P＜0.05）。

圖2 EGCG增強順鉑對NCI?H520 和 NCI?H1975 細胞的抑制作用Fig.2 EGCG enhanced inhibitory effect of Cisplatin on the proliferation of NCI?H520 and NCI?H1975 cells

2.3 EGCG 對NCI?H520 和NCI?H1975 細胞內(nèi)鉑和DNA?鉑加合物含量的影響EGCG與順鉑合用作用細胞24 h，相比于順鉑單獨作用，細胞內(nèi)鉑和DNA?鉑加合物含量明顯增加（P＜ 0.05），見圖3。

2.4 EGCG和順鉑合用對NCI?H520和NCI?H1975細胞凋亡的影響聯(lián)合EGCG與順鉑時，兩種細胞的細胞核固縮明顯，數(shù)量較多，細胞凋亡增加。見圖4。

圖3 EGCG和順鉑合用提高細胞內(nèi)順鉑及DNA?順鉑加合物含量Fig.3 The combination of EGCG and Cisplatin increases Pt and DNA?Pt adducts accumulation in the cells

圖4 EGCG和順鉑合用促進細胞凋亡Fig.4 The combination of EGCG and Cisplatin promotes the cell apoptosis

2.5 EGCG和順鉑合用對NCI?H520和NCI?H1975細胞EGFR的影響聯(lián)合使用EGCG與順鉑明顯降低細胞內(nèi)EGFR mRNA和磷酸化EGFR的表達（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

EGFR及其下游分子下調(diào)可抑制腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡［15-17］。順鉑作為臨床重要的NSCLC治療藥物之一，其敏感性受到EGFR信號調(diào)節(jié)［18］。研究證實，順鉑治療效果與EGFR突變密切相關(guān)［19］。因此，聯(lián)合EGCG與順鉑可能在NSCLC治療方面前景廣闊。

圖5 EGCG和順鉑合用明顯降低細胞內(nèi)EGFR mRNA和磷酸化EGFR的表達Fig.5 The combination of EGCG and Cisplatin reduces EGFR mRNA and phospho?EGFR expression in the cells

本研究證實，EGCG能有效抑制人NSCLC細胞株 NCI?H520 和 NCI?H1975 體外增殖和誘導(dǎo)凋亡，并且與順鉑合用作用增強。為鑒定EGCG的特異性，首先檢測細胞中順鉑及DNA?順鉑加合物含量。發(fā)現(xiàn)EGCG明顯誘導(dǎo)細胞內(nèi)Pt?DNA復(fù)合體的堆積。提示EGCG可改善人NSCLC細胞株對順鉑的敏感性降低?？紤]加合物通過阻斷DNA復(fù)制而抑制細胞增殖［19］，同時，文獻［6］報道EGCG影響多種癌細胞的凋亡。因此，我們進一步檢測其對細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG增強癌細胞的核固縮。證實EGCG可能通過改變DNA促進細胞凋亡。而EGFR是已知的NSCLC中高突變和高表達的分子受體，也與細胞增殖凋亡相關(guān)［8］。因此本研究亦檢測了其蛋白和mRNA含量。結(jié)果顯示，EGCG和順鉑合用明顯抑制NSCLC癌細胞EGFR的磷酸化和mRNA表達。

綜上所述，EGCG聯(lián)合順鉑的抗NSCLC作用機制可能通過下調(diào)EGFR轉(zhuǎn)錄和EGFR磷酸化，抑制DNA合成依賴性的增殖和促進凋亡。本課題組曾選取人NSCLC細胞株NCI?H520和NCI?H1975細胞作為研究對象，首次發(fā)現(xiàn)EGCG具有相當(dāng)?shù)捏w外抑制NSCLC效果。同時又可增強順鉑的殺傷作用和降低其毒性。然而，EGCG是如何上調(diào)EGFR的轉(zhuǎn)錄活性和提高EGFR蛋白磷酸化水平，有待進一步證實，且是否有在體藥理學(xué)效應(yīng)和相似機制，以及對EGFR突變NSCLC的作用，仍有待研究。而本研究為將其聯(lián)合順鉑開發(fā)成為一種高效低毒的抗腫瘤藥提供了一定的依據(jù)，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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