李 毅，尹鵬濱，鄧 元，孟鈺童，呂厚辰，張里程，唐佩福解放軍總醫(yī)院，北京 100853

糖皮質(zhì)激素類藥物目前應用廣泛，其在炎癥性疾病和自身免疫性疾病等的治療中發(fā)揮了重要作用。然而長期、大劑量應用糖皮質(zhì)激素類藥物會導致多種骨相關疾病如骨質(zhì)疏松、骨壞死等[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素能夠通過影響成骨細胞和破骨細胞活性從而打破骨代謝平衡，最終導致骨量丟失[3-4]。有研究指出糖皮質(zhì)激素能夠改變骨代謝相關miRNA的表達，從而引起骨細胞的增殖、凋亡等改變[5]。Shi等[6]發(fā)現(xiàn)過表達的miR-199a通過偶聯(lián)WNT信號通路能夠增強糖皮質(zhì)激素對成骨細胞增殖的抑制作用。Li等[7]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素刺激后的間充質(zhì)干細胞在成骨分化過程中miRNA的表達會發(fā)生變化，其中9種miRNA表達上調(diào)，7種miRNA表達下調(diào)。有研究報道成骨細胞表達的miR-17/20a能夠抑制糖皮質(zhì)激素對破骨細胞分化的誘導作用[8]。以上研究提示糖皮質(zhì)激素能夠改變骨相關細胞miRNA的表達，進而對骨代謝過程產(chǎn)生影響，然而其具體機制仍然不明確。近年來，外泌體(exosome)因廣泛參與疾病病理生理過程而成為研究熱點。外泌體是一種納米級別的囊泡，可由機體的多種細胞分泌，且廣泛分布于唾液、血漿、血清、尿液、乳汁等體液中，其內(nèi)部包裹了蛋白質(zhì)、mRNA、miRNAs、細胞因子等物質(zhì)[9-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，血漿及血清中的miRNAs主要來源于外泌體，而外泌體可以保護循環(huán)miRNAs，使得miRNAs不被RNA酶降解[13-14]。外泌體源性miRNAs具有調(diào)節(jié)細胞間通訊的重要功能，是疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[15-17]。本研究通過用不同濃度地塞米松刺激骨相關細胞后提取其分泌的外泌體，對外泌體內(nèi)miRNA變化進行檢測，探索糖皮質(zhì)激素對外泌體源性miRNA的調(diào)節(jié)作用，為糖皮質(zhì)激素對骨代謝機制的影響提供新的思路。

材料和方法

1 主要試劑和藥品 DMEM培養(yǎng)液、αMEM培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清(Gibco公司)；地塞米松、胰蛋白酶(Sigma公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；MC-3T3-E1細胞株、RAW264.7細胞株(解放軍總醫(yī)院骨科研究所)；細胞外囊泡(外泌體)分離柱(Izon公司)；超濾管(millipore公司)。

2 MC-ETE-E1細胞培養(yǎng) 將MC-3T3-E1細胞株復蘇后使用含10%胎牛血清，青鏈霉素雙抗αMEM培養(yǎng)基作為MC-ETE-E1細胞的培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每48 h換液1次，待細胞增殖到培養(yǎng)皿面積80%時可進行傳代。

3 RAW264.7細胞培養(yǎng) 將RAW264.7細胞復蘇后使用10%胎牛血清，青鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2環(huán)境進行培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，待細胞增殖到培養(yǎng)皿面積80%時可進行傳代。

4 細胞外泌體 提取采用無外泌體血清配制細胞所需培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細胞上清，4℃條件下2 000×g離心10 min、12 000×g離心45 min取上清，110 000×g離心2 h，取沉淀用1 ml PBS重懸，經(jīng)0.22μm孔濾器過濾后，110 000×g離心70 min，棄上清后用1 ml PBS重懸，110 000×g離心70 min，棄上清后用1 ml PBS重懸沉淀后-80℃保存。

5 外泌體內(nèi)RNA提取 向含有外泌體的EP管中加入1 ml TriZol，做好標記后置于冰盒中。將EP管簡單離心，反復搖晃、震蕩，冰盒中孵育0.5 h，以有利于RNA與核糖體完全分離。向EP管中加入0.2 ml氯仿，蓋好離心管，劇烈搖晃2 min后室溫孵育10 min。4℃，12 000 r/min，離心15 min。取500μl上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，EP管置于

插板中，向EP管中加入500μl異丙醇，簡單離心，搖晃混勻并室溫孵育10 min。4℃，12 000 r/min，離心10 min。棄上清，加入1 ml 75%乙醇，將沉淀從管壁上洗滌下來。4℃，7 400 r/min，離心5 min。棄上清，室溫干燥10 min，加入15 μl DEPC水，簡單離心，之后-80℃保存。

6 CCK-8測定細胞活性 將MC-ETE-E1與RAW 264.7分別以2×104/孔的細胞密度接種于96孔板培養(yǎng)24 h，分4組，每組設5個復孔，4組分別為1μg/ml DEX、10μg/ml DEX、100μg/ml DEX 以及空白對照組(加PBS溶液補足體積)，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，利用CCK-8實驗檢測細胞活性。

7 外泌體表型鑒定 1)透射電鏡觀察：將獲得的外泌體加入4%多聚甲醛溶液中，固定后吸取適量滴至透射電鏡銅網(wǎng)上，PBS清洗銅網(wǎng)8次，加入1%戊二醛固定5 min，蒸餾水清洗2次后采用0.4%醋酸雙氧鈾將樣品染色5 min，室溫干燥30 min后采用透射電鏡在120 kV下觀察并拍照。2)外泌體顆粒直徑分析：取外泌體10μl加90μl PBS，充分吹打混勻后，加入粒徑分析儀中進行測定。3)外泌體CD9、CD81 Western blot鑒定：BCA測定外泌體蛋白濃度，取30μg上述外泌體蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳2 h，100 V電壓下100 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后，分別孵育相應的一抗4℃過夜(CD81抗體，l∶100稀釋；CD9抗體，1：100稀釋)。采用PBST洗滌5 min×3次，二抗常溫孵育1 h，PBST洗滌5 min×3次，ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

8 RT-qPCR檢測外泌體內(nèi)miRNA表達 1)將逆轉(zhuǎn)錄引物(miR-133、miR-214、miR-4697和miR-487)簡單離心震蕩混勻，置于70℃水浴鍋中，預變性5 min，然后置于冰上2 min，作為反應體系。2)將所提取的MC-3T3-E1和RAW264.7細胞外泌體內(nèi)RNA加入反應體系，每組加入8.4 μl配置好的RT-Mix。3)設置反轉(zhuǎn)錄程序，退火溫度25℃，時間5 min，延伸42℃，時間60 min，失活70℃，時間15 min，之后開始進行PCR擴增，PCR體系中各組分體積：Temple cDNA 2μl、Sense+Antisense(10μmol/L) 2 μl、Bestar qPCR MasterMix 10 μl、ddH2O 6μl，PCR反應程序設置：預變性95℃，2 min，變性95℃，10 s，退火/延伸60℃，30 s，72℃，30 s，95℃，1 min，進行40個循環(huán)融解曲線分析60℃，1 min。

9 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0軟件、GraphPad Prism 6軟件完成，數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較采用方差分析，事后檢驗采用SNK法；P＜0.05差異為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度地塞米松刺激下成破骨細胞活力變化從圖1中可以看出不同濃度地塞米松均能夠抑制MC-3T3-E1的增殖，且隨著地塞米松濃度增加其抑制作用逐漸增強。地塞米松對RAW264.7增殖具有抑制作用，高濃度地塞米松(100μg/ml)抑制作用較低濃度地塞米松(1μg/ml，10μg/ml)強(P＜0.05)。以上結果提示地塞米松對成骨細胞和破骨細胞均具有抑制作用，且程度有所不同。

2 外泌體表型鑒定 透射電鏡下外泌體呈現(xiàn)典型杯口狀形態(tài)(圖2A)，外泌體平均粒徑大多為100 nm(圖2B)，所獲得的納米粒子復合外泌體范圍。CD9、CD81為囊泡表面跨膜蛋白，Western blot結果顯示MC-3T3-E1與RAW264.7兩種細胞外泌體均表達CD9和CD81(圖2C)，證實了提取物確實是外泌體。

3 不同濃度地塞米松刺激后外泌體內(nèi)miRNA的變化 qRT-PCR檢測顯示(圖3)地塞米松會降低成骨細胞外泌體內(nèi)miR-133、miR-214、miR-4697的含量，且隨著地塞米松濃度增加miRNA含量遞減；低劑量地塞米松能夠增加miR-487含量，而高劑量時miR-487含量顯著下降(P＜0.05)。對于破骨細胞，相比于空白對照組，1μg/ml地塞米松能夠顯著增加外泌體內(nèi)miR-133、miR-214、miR-487和miR-4697的含量(P＜0.05)，而在10μg/ml時4種miRNA均降低到空白對照組水平以下，

100μg/ml時 miR-214含量上升明顯(P＜0.05)，而miR-133、miR-487、miR-4697含量無顯著變化(P＞0.05)。由此我們推測地塞米松會影響成骨細胞和破骨細胞分泌外泌體內(nèi)miRNA含量，可能產(chǎn)生了骨重塑的調(diào)節(jié)。

討 論

近年來，外泌體在骨科疾病中的作用越來越受關注。Cui等[18]研究發(fā)現(xiàn)，礦化的成骨細胞分泌的外泌體能夠進一步促進成骨細胞的礦化，且成骨細胞內(nèi)的miRNAs表達譜發(fā)生顯著改變，由此激活Wnt信號通路來促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化。不僅成骨細胞外泌體能夠調(diào)控骨代謝，有研究表明破骨細胞來源的外泌體也能夠通過調(diào)節(jié)miR-214-3p的表達進而抑制成骨過程[19]。Huynh等[20]研究表明，破骨細胞前體細胞來源的外泌體能促進破骨生成，而成熟破骨細胞來源的外泌體卻抑制破骨生成。破骨前體細胞來源的外泌體可能是破骨骨吸收作用的重要調(diào)節(jié)劑，而外泌體傳遞的RANK蛋白可能是調(diào)節(jié)骨吸收作用的關鍵環(huán)節(jié)。隨著研究的不斷深入，外泌體對糖皮質(zhì)激素導致的骨相關疾病的研究也逐漸豐富。有研究者發(fā)現(xiàn)滑膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體對激素誘導性股骨頭壞死具有治療作用，滑膜間充質(zhì)干細胞源性外泌體能夠在體外促進間充質(zhì)干細胞的增殖并能夠抗凋亡，體內(nèi)研究表明外泌體能夠?qū)晒穷^產(chǎn)生保護作用[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)IPS誘導的間充質(zhì)干細胞來源外泌體也有相似的保護作用[22]。血小板富集的外泌體能夠通過Akt/Bad/Bcl-2信號通路抑制股骨頭骨壞死進程，抑制糖皮質(zhì)激素對間充質(zhì)干細胞、成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞的促凋亡作用[23]。然而外泌體在糖皮質(zhì)激素對骨代謝影響過程中的作用機制仍然不明確。

本研究通過用不同濃度地塞米松刺激成骨細胞和破骨細胞，提取分泌的外泌體，發(fā)現(xiàn)地塞米松可導致成骨細胞和破骨細胞分泌的外泌體內(nèi)miRNA表達產(chǎn)生變化，說明外泌體可能是地塞米松作用于骨代謝的一個重要中間環(huán)節(jié)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松人群外周血外泌體內(nèi)miR-133、miR-214、miR-487和miR-4697的表達有顯著差異，而既往研究已證實外泌體來源miR-214廣泛參與骨形成和骨吸收過程[19,24]，miR-133參與調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞成骨分化過程[25]，以上提示我們這4種miRNA可能與骨代謝過程密切相關。本研究結果顯示，地塞米松刺激能夠降低成骨細胞內(nèi)miR-133、miR-214、miR-4697的含量，且隨著地塞米松濃度增加miRNA含量遞減；低劑量地塞米松能夠增加miR-487含量，而高劑量時miR-487含量會顯著下降。地塞米松刺激破骨細胞后，低劑量地塞米松(1μg/ml)能夠顯著提高外泌體內(nèi) miR-133、miR-214、miR-487和 miR-4697的含量(P＜0.05)，而在10μg/ml時4種miRNA均降低到空白對照組水平以下，100μg/ml時miR-214含量上升明顯，而miR-133、miR-487、miR-4697含量無顯著變化。以上結果提示我們這4種miRNA參與了地塞米松影響骨生成和骨吸收過程，但仍然需要進一步研究揭示其具體的作用機制。

目前外泌體在骨組織中作用的研究還處于初始階段，隨著對外泌體研究的深入，其對靶細胞間的信號機制會更加明確，對疾病診斷和尋找治療新靶點具有重要的臨床意義。

圖 1 不同濃度地塞米松環(huán)境下成破骨細胞活力變化 A： 地塞米松對成骨細胞增殖影響； B： 地塞米松對破骨細胞增殖影響Fig. 1 Effect of dexamethasone on the viability of osteoblasts and osteoclasts A: Dexamethasone at different concentrations on the viability of osteoblasts; B: Dexamethasone at different concentrations on the viability of osteoclasts

圖 2 外泌體表型鑒定 A： 透射電鏡下外泌體； B： 外泌體粒徑分布圖； C： Western blot外泌體表面標記鑒定(CD9、CD81);左為成骨細胞來源外泌體，右為破骨細胞來源外泌體Fig. 2 Characterization of exosomes A: Morphology of exosomes under a transmission electron microscopy (Scale bar: 100 nm); B: Particle size distribution of exosomes; C: Western blott analysis of exosomal surface markers (including CD9 and CD81); Left for osteoblastderived exosomes, right for osteoclast-derived exosomes

圖 3 不同濃度地塞米松刺激后外泌體內(nèi)miRNA的變化 A： 成骨細胞外泌體內(nèi)miRNA含量變化； B： 破骨細胞外泌體內(nèi)miRNA含量變化Fig. 3 Effect of dexamethasone on exosomal miRNAs derived from osteoblasts and osteoclasts A: Changes of content of miRNAs in osteoblast exosomes; B: Changes of content of miRNAs in osteoclast exosomes

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